周雍进团队实现木质纤维素水解物中混合糖的协同发酵

通过木质纤维素的生物炼制来生产燃料乙醇、化学品等生物基产品，对于能源安全、环境保护和促进可持续发展等具有重要意义。想要提高木质纤维素生物精炼厂的效率和盈利能力，实现木质纤维素水解物中混合糖的高效协同发酵是关键问题之一。这里的混合糖指的是葡萄糖（C6 糖）和木糖（C5 糖），在木质纤维素生物质中含量分列第一和第二。

混合糖高效协同利用的难点在于，木糖同化受限和葡萄糖抑制效应。木糖的高效转化也是长期以来的一大挑战。

（来源：Nature Chemical Biology）

近日，中国科学院大连化学物理研究所周雍进研究员团队在Nature Chemical Biology上发表题为“Engineering co-utilization of glucose and xylose for chemical overproduction from lignocellulose”的研究工作。报道了在多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha，Hansenula polymorpha）中强化木糖同化与转运过程，实现了葡萄糖与木糖同步利用，并高效合成了脂肪酸和 3-羟基丙酸。该工作的共同第一作者是中国科学院大连化学物理研究所副研究员高教琪和博士后禹伟，通讯作者为周雍进研究员，南京理工大学金明杰教授参与制备了纤维素水解液。上述工作得到国家自然科学基金、大连化物所科研创新基金等项目的资助。

O. polymorpha天然具有相当强的木糖利用能力，被猜测是有效发酵葡萄糖和木糖的理想宿主，且此前已被广泛用作蛋白表达的重要宿主。此外，O. polymorpha的耐高温（超过 50 °C）使其有希望同时进行木质纤维素的糖化和发酵，从而降低冷却成本和污染风险；相对有限的副产品积累也有助于O. polymorpha的高密度发酵和高产品产量。

在O. polymorpha存在的原生木糖代谢的基础上，周雍进团队又系统地对其进行改造。

▲图丨将O. polymorpha改造成细胞工厂，从木质纤维素生物质中生产脂肪酸和3-羟基丙酸（来源：Nature Chemical Biology）

为了高效生产脂肪酸，研究人员首先需要提高 NADPH 和乙酰-CoA 的供应量。

提高 NADPH 的供应量的操作如下：第一，通过过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（ZWF1）增强磷酸戊糖途径（PPP），这是 NADPH 的主要来源；第二，通过过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因（PCK1）和果糖二磷酸酶基因（FBP1）加强葡萄糖的生成途径。

为了增加前体乙酰-CoA 的储备，研究人员采用了三种工程策略，并过量表达基因ACC1（编码乙酰-CoA 羧化酶）。

经过以上操作获得的工程底盘细胞，能够以葡萄糖为原料生产 30.0克/升脂肪酸，最高生产率为 0.27克/升/小时。

接下来，要提高木糖的同化与转运效率。

研究人员观察发现，木糖难以高效转化是由于依赖 NADPH 的原生木糖还原酶 (XR) 和依赖 NAD+ 的木糖醇脱氢酶 (NAD+ dehydrogenase) 的辅因子失衡造成的。

因此，研究人员通过过表达来自Piromycessp. (PspXI*) 和Lachnoclostridium phytofermentans（LpXI*）的木糖异构酶（XIs）作为原生 XR-XDH 途径的补充，并加强原生木糖异构酶（XYL3）的表达，提高了木糖的分解代谢。其中，过表达XYL3在提高木糖利用率方面发挥最重要的作用。

木糖的利用缓解了辅因子的不平衡，并大大提高了木糖的利用率。研究人员还在强启动子（PGAP）和中启动子（PPGD1）的控制下，在工程菌株中引入了对木糖具有更高亲和力的己糖转运蛋白（HXT1*），增加了木糖的吸收。

▲图丨为了实现木糖和葡萄糖的同步利用，引入了对木糖亲和力更高的己糖转运蛋白（HXT1*）（来源：Nature Chemical Biology）

加强木糖的吸收和分解促进了葡萄糖和木糖的同步利用，而不会影响原生葡萄糖的代谢。经以上操作，在葡萄糖与木糖模拟物料中，脂肪酸产量达到 38.2g/L；在真实木质纤维素水解液中，脂肪酸产量达到 7.0g/L。

FFAs 的高水平生产表明，O. polymorpha具有从葡萄糖和木糖合成乙酰-CoA 衍生物的潜力。进一步借助代谢转换策略，研究人员将这一木质纤维素生物炼制平台扩展到 3-羟基丙酸（3-HP） 的生产，3-羟基丙酸与 FFA 的生物合成有着相同的前体乙酰-CoA 和辅助因子 NADPH。最终获得了 79.6g/L 的 3-羟基丙酸，是目前报道的最高产量。

总之，这项研究设计O. polymorpha作为底盘细胞，同步利用葡萄糖和木糖生产乙酰-CoA 衍生化学品。表明O. polymorpha在作为木质纤维素生物精炼厂来生产多功能增值化学品方面具有巨大潜力。

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