miRNA水平上解析荔枝果实衰老和果皮褐变的机理。

荔枝因其鲜艳的色泽和丰富的营养成分而具有很高的商业价值。然而，它会变质，果皮在收获后 1-2 天内变成棕色。介导荔枝果实衰老的因素很复杂。MicroRNA作为负调节因子，几乎参与所有生理过程。为了解荔枝果实衰老和果皮褐变在miRNA水平上的机理，对RNA文库和一个荔枝果皮经常温贮藏和冷藏后货架期制备的degradome文库进行了测序。

荔枝是中国的土生土长，由于其颜色鲜艳，果肉中含有丰富的营养成分，在国际市场上具有很高的商业价值。然而，这种易腐烂的果实在收获后会迅速衰老，这反映在环境温度下果皮在1-2天内褐变。水果衰老受多种内部和环境因素控制，每个因素上调衰老相关基因（SAGs）的一个子集，这些基因依次参与感知、信号转导途径和下游反应;所有这些基因都受到复杂的调控串扰的影响。

据报道，细胞能量状态在调节荔枝果实衰老和褐变中起着至关重要的作用[5]。据报道，snf1相关激酶1（SnRK1）作为能量调节因子参与碳氮代谢的全球调控，进一步影响细胞能量水平。此外，病原体感染通常诱发果实衰老和褐变。植物有自己的防御病原体攻击的机制，其中胼胝糖的积累很重要。转录因子（TFs）通常调节广泛的生物过程，包括衰老。例如，MYB在水果衰老中起着重要作用[11];特别是，据报道它们广泛参与花青素代谢的调节[，这是影响果皮褐变的重要因素。

MicroRNA（miRNA）是在植物、动物甚至病毒中发现的内源性非编码小RNA。它们通过mRNA降解或翻译抑制调节基因表达在植物发育中发挥重要作用。在植物中，切割发生在mRNA-miRNA双链体的中间。因此，靶mRNA的3'片段在其5'末端具有单磷酸盐，这是验证miRNA靶标的重要因素。近年来，随着高通量测序的快速发展，从不同的植物物种中鉴定出许多miRNA及其靶基因。这些miRNA及其靶标的发现使得进一步了解miRNA介导的基因调控网络和生物学机制成为可能。然而，人们对荔枝中的miRNA知之甚少。

先前的研究表明，miRNA可以介导植物衰老。例如，已发现miR164调节NAC转录因子ORE1，并且在miR164突变体中加速衰老。在另一种情况下，miR390触发TAS3产生反式作用siRNA，导致生长素响应因子ARF2/3/4的mRNA降解，并最终影响衰老的时间。此外，据报道，靶向TCP转录因子的miR319的过表达导致保持绿色表型。

关于水果，只有少数miRNA（miR156和miR172）被验证可以微调CNR和AP2a的表达，这是番茄果实成熟的重要调节因子。然而，人们对miRNA表达及其在储存的水果衰老中的靶标知之甚少。因此，我们的研究对荔枝以外的储存水果具有更广泛的吸引力。

为了解miRNA对荔枝果实衰老的调控规律，对5个不同温度下贮藏后的荔枝果实小RNA文库和一个混合荔枝文库进行了测序。MiRNA及其靶标使用转录组测序组装的荔枝单基因参考进行鉴定。然后通过茎环实时定量RT-PCR验证了多种miRNA，并提出了荔枝褐变和衰老中可能的miRNA靶调控网络。本研究为进一步了解荔枝果实中miRNA介导的衰老提供了基础信息，并为延缓采收园艺产品衰老提供了新的理论策略。

从荔枝果皮的45 d-、0 d-、4 d 14 h-、0 d 14 h-和24 d 14 h衍生的sRNA文库的高通量测序中总共获得了约48万个可靠的读数。首先通过去除3′衔接子序列来处理所有读数，并排除复杂度低的读取以及与t / rRNA同源的读取。大约10%的读数与荔枝单基因组装对齐，最多有一个不匹配，20~24个核苷酸的读数用于进一步分析。

来自五个文库的sRNA的长度分布显示出不均匀的模式。一般来说，大多数小RNA的大小分布在20到24-nt之间，最丰富的是24-nt，其次是22-nt和23-nt.。观察到不同成熟sRNA优势变化的一个可能原因可能是各种sRNA生物发生途径的差异活性。成熟sRNA的大小和产生的sRNA比例的复杂性是可以区分各种sRNA途径的两个关键特征。我们在数据中观察到，24-nt sRNA是最丰富的一类sRNA，这与之前的报告一致。

这种对24-nt sRNA的偏向在冷藏后的荔枝中特别强烈。相反，1个核苷酸sRNA在冷藏时显示出浓度降低。 这种权衡表明，不同的sRNA途径在储存过程中是相互关联的。出乎意料的是，在我们的研究中，22-nt sRNA的浓度低于23-nt和1-nt sRNA，这表明荔枝可能只含有有限数量的miRNA，或者荔枝中miRNA的长度可能差异很大。

荔枝果实中已知的miRNA通过与miRNA存储库（miRBase 20，[31]）中的序列匹配来鉴定，允许多达两个错配。总共鉴定出296个miRNA，其中来自65个家族的19个miRNA显示>50个总读数，来自37个家族的11个miRNA显示>10个总读数，并且还鉴定了母离子序列。根据前体序列，这2个miRNA被分为296个miRNA家族。

已知miRNA的表达水平，如归一化读数所反映的那样，在不同时间点的水果样品中，各家族之间存在很大差异。miR49、miR319 和 miR396 的读取丰度最高，范围为 159，16 至 155，5，比其他相对丰度的 miRNA 家族高出许多倍，包括 miR466、miR393、miR166 和 miR162，其总丰度范围为 160 至 159。

这些miRNA在各种植物物种中高度保守。此外，在我们的数据集中还鉴定出许多仅在少数植物物种中发现的不太保守的miRNA，例如miR2，miR403，miR858，miR477和miR530，总丰度从894到37不等。

有趣的是，我们注意到来自荔枝单基因2的lch-miR159前体的普遍同构过程，其精确地产生了三种miR45530亚型，其159'末端的尿苷数量可变，丰度变化很大。.有更多的sRNA读段与成熟的miR2同源，具有一个或两个错配，这些读段也可能来自这个单基因。

在排除与已知miRNA匹配的sRNA读数后，使用MiRCat和RNAfold鉴定荔枝中的新型miRNA（20~24-nt）。当推定的miRNA符合植物miRNA鉴定标准时，它们最终被认为是新的miRNA候选者[32]。该分析在荔枝中从11个单基因中产生了10个新的miRNA候选物（表1，附加文件3和4），称为荔枝特异性miRNA。其中只有两个属于21或22-nt类的miRNA，而其余的都属于23或24-nt类。

相同数量的miRNA来自义链和反义链。与lch-miR159类似，两个荔枝特异性miRNA（lch-miRC5和lch-miRC10）仅在5'末端的两个核苷酸上有所不同，被鉴定为来自同一个单基因41226。一般来说，与大多数已知的miRNA相比，荔枝特异性miRNA的丰度较低。例如，只有lch-miRC1的总读取丰度大于400，而11个候选者中有120个产生的水平小于1。此外，大多数荔枝特异性miRNA表现出阶段特异性表达模式。

为了确认上述荔枝miRNA的存在和表达，选择了29个miRNA（19个已知的miRNA和10个新型miRNA）进行茎环qRT-PCR分析。. 一般而言，与0 d时相比，这些miRNA在不同贮藏期均表现出显著的表达变化。具体而言，23个miRNA在冷藏后14 d 0 h上调，其中lch-miR396e、lch-miRC10和lch-miRC5的相对表达水平分别为11.0、12.7和14.5。

值得注意的是，在25 °C下储存24 d后，大多数miRNA的表达在14 °C下储存1 h时变化很快。 lch-miR396e、lch-miRC10和lch-miRC5的表达水平分别下降了9.07倍、12.35倍和14.16倍。 此外，与其他miRNA相比，lch-miR396v_6，lch-miR397，lch-miRC1始终下调。此外，一些miRNA在低读数甚至没有读数的情况下测序，但它们通过qRT-PCR检测到，例如lch-miR159v_19，lch-miR319v_16和lch-miRC11。 同样，一种miRNA（lch-miRC9）未通过qRT-PCR检测到，而是从测序数据中鉴定出来。

为了鉴定我们数据集中荔枝miRNA的靶标，根据从先前转录组分析中获得的有关miRNA和mRNA序列的信息进行了degradome测序。共生成了32，396，114个原始读段，其中7，677，220个（23.7%）唯一原始读段和13，087，512个（40.4%）cDNA映射读段，其中27，015个覆盖的cDNA被获取。

经过CleaveLand 3.0的处理和分析，鉴定出197个已知miRNA靶向的167个基因。确定的目标进一步分为五类。在已知miRNA家族的靶标中，40个属于0类，代表对应于切割位点和匹配的同源转录本的最丰度的degradome标签，198个属于第2类，其切割丰度高于中位数但低于最大值。对于不同的miRNA，已鉴定的基因靶标的数量差异很大。

结果表明，大多数miRNA可以调节一个以上的靶基因，尤其是miR396家族中的miRNA，如lch-miR396v_1（11个靶点）、lch-miR396v_7（10个靶点）、lch-miR396v_10（11个靶点）、lch-miR396v_12（13个靶点）和lch-miR396v_31（15个靶点）。这与miR396家族成员在整个荔枝果实贮藏过程中的高表达相对应。

相反，一个靶基因可能受到相同或不同切割位点的多个miRNA的调控，特别是对于注释为MYB转录因子的lychee_43435，该转录因子被来自miR31和miR159家族的319个miRNA靶向，这表明MYBs作为各种生物过程中的关键转录因子，很可能受到miRNA的严格控制。

还鉴定了11种荔枝特异性miRNA的基因靶标。在确定的五个基因靶标中，一个属于第0类，两个属于第2类，其余两个属于第4类。虽然荔枝特异性miRNA的大多数靶标具有合理的比对评分，但它们的注释相对较差;只有两个基因分别被注释为NAC转录因子和钙蛋白相关蛋白。

为了更好地了解荔枝miRNA的潜在生物学功能，对鉴定出的靶基因进行了基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析。在所有功能类别中，参与核成分的靶标占据频率最高，其次是参与DNA依赖性转录、DNA依赖性转录调控和DNA结合的靶标，表明大多数靶标是转录因子。

此外，还存在一些低频但与荔枝果实褐变和衰老密切相关的生物过程。这些包括对细菌/真菌的防御反应、生长素/乙烯信号通路、细胞壁组织和花青素代谢。KEGG分析表明，这些靶点在代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程等五个方面发挥作用。在KEGG功能分类中，还发现了一些与衰老相关的靶基因类别，例如细菌入侵上皮细胞，类黄酮生物合成和植物 - 病原体相互作用。

为了筛选最有可能对采后荔枝果实衰老有反应的miRNA及其靶基因，进行了几个步骤。首先，基于GO/KEGG功能分类和非冗余（Nr）注释，筛选出62个与果实褐变和/或衰老相关的靶基因。这些靶点主要与细胞壁组织、病原体防御、激素信号传导、花青素代谢途径和能量调节有关。

这里需要注意的是，这62个靶标中，有的被多个miRNA切割，比如lychee_55456被10个miRNA靶向，有的靶标被预测参与不止一个过程，比如lychee_9267同时参与细胞壁和花青素的组织。其次，根据转录组测序获得的表达进一步过滤上述靶标。在30个采样时间点，排除最高表达水平不超过40 rpkm的基因。

衰老是与植物蛋白水解密切相关的生理过程。衰老相关的蛋白水解可能引发相关蛋白质的大规模降解网络，并最终导致细胞死亡。本研究冷藏后CP1基因与0 d时相比下调。然而，当果实从低温转移到室温时，CP1在货架期内表现出明显的表达增加。

CP1表达的这种波动部分得到了先前结果的支持，该结果证实了低温可以抑制果实衰老，而加速果实衰老与冷藏后有关[。此外，鉴定出靶向CP396的lch-miR1a通过qPCR表现出相反的表达趋势，特别是在冷藏和冷藏后。

完全符合miRNA作用的机制。然而，在室温储存期间，miRNA在2天时上调了5.4倍，而其靶标CP1在表达上没有变化，这意味着CP1的激活或抑制也可能取决于pH，其他蛋白酶的作用以及细胞或细胞外环境。

通过将sRNA读数比对到荔枝单基因组装上，首先从荔枝中鉴定出属于296个已知miRNA家族的49个miRNA。此外，还鉴定了11个荔枝特异性miRNA。其中，鉴定出167个已知miRNA可切割197个靶标，14个荔枝特异性miRNA具有<>个靶标。通过对茎环定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和转录组分析的结合分析，发现<>个miRNA靶对积极参与荔枝果实衰老相关过程，包括能量调节、花青素代谢、激素信号传导和病原体感染防御。