ADC旁观者效应：意料之内，还是意外之喜？

抗体偶联药物（antibody drug conjugate，ADC）是近些年抗肿瘤药物研发的热点。 “旁观者效应” 已经成为国内外共同接受的新概念，随着T-DXd在DESTINY系列研究中的优异表现，似乎加强了旁观者效应在临床疗效中的作用认知，或成为药企不可或缺的“标配”。然而，随着更多临床前和临床研究数据的公布，旁观者效应是一个成功ADC 普遍需要 具备的特征？还是 个性化 ADC设计中的一个重要因素，这个问题或许等待解答。

首先，简单回顾一下旁观者效应的基础知识。ADC主要包含三个成分：抗体，连接子（linker），载荷（payload）。每个抗体搭载的载荷的平均数量称为药物-抗体比例（drug-to-antibody ratio，DAR），这些结构确定了该ADC的特异性药理学和临床活性，每个ADC与肿瘤微环境（TME）之间可能会产生复杂的相互作用。

2013年，美国FDA批准恩美曲妥珠单抗（T-DM1）用于HER2阳性晚期乳腺癌的治疗，标志着ADC进入实体瘤领域。ADC治疗实体瘤有一个重要挑战，就是靶抗原（Ag）在肿瘤组织或转移灶上的 异质性表达 ，即可能同时存在Ag高表达、低表达或不表达的细胞，从而影响ADC疗效。而“旁观者效应”——这种独特但仍存在争议的现象，被认为可以改善异质性表达肿瘤中的ADC活性。

ADC发挥作用的主要步骤包括：1）ADC与肿瘤细胞靶抗原结合；2）通过内化作用进入肿瘤细胞；3）溶酶体降解；4）释放出细胞毒性载荷。“旁观者”，顾名思义，就是指靶抗原阳性细胞 周围的细胞 ，无论这些细胞是否表达靶抗原或表达水平如何。

一、旁观者效应的临床前数据

旁观者效应是部分ADC的特征，这种药理学特征可能与ADC的设计密切相关，尤其是和连接子以及载荷的生化特征有关。

首先，抗体-连接子的化学稳定性至关重要，如果要在ADC 内化前 释放细胞毒性载荷，从而对靶抗原阳性细胞周围的细胞产生杀伤作用，则需要在ADC特异性和对正常组织的损伤之间取得平衡。

连接子大致分为两类：可切割型，不可切割型。具有可切割型连接子的ADC，或能在抗体-抗原结合前，在TME中释放载荷而显示出脱靶（off-target）效应，这取决于氧化还原环境、低pH和细胞外蛋白酶。例如：pH依赖性连接子可以在较低pH的TME中自然水解，这和糖酵解以及乳酸生成加强有关；二硫键连接子对还原性TME敏感等。相比之下，不可切割连接子在血浆中更稳定，但是其抗体-连接子结构依赖溶酶体降解以释放载荷，常导致载荷上的带电氨基酸保留，这可能会影响药物疗效或细胞通透性。

载荷方面，应能够穿透细胞膜磷脂双层离开靶细胞，才能杀伤周围的肿瘤细胞。因此，载荷应该是非极性或疏水性的。

注：图的左侧部分显示了肿瘤内异质性，也就是以亚克隆进化的形式发展，这是实体瘤的典型特征之一。图中的绿色细胞代表靶抗原高表达的肿瘤细胞；蓝色细胞代表靶抗原低表达的肿瘤细胞；黄色细胞代表不表达靶抗原的细胞。

德曲妥珠单抗（T-DXd）是一种新型ADC，结合了曲妥珠单抗和一种有效的拓扑异构酶I抑制剂——DXd，与T-DM1的载荷DM1相比，DXd具有高细胞膜穿透性，可扩散至邻近细胞。T-DXd具有可切割连接子，能被溶酶体酶选择性切割，这些酶在肿瘤细胞中高度表达；而T-DM1使用的是不可切割连接子，其载荷DM1是极性的，不能穿透细胞膜。T-DXd和T-DM1都需要识别肿瘤细胞表面的HER2胞外结构域，内化后才能发挥抗肿瘤活性。但是，T-DM1的抗体-连接子结构依赖溶酶体降解以释放载荷，常导致载荷上的带电氨基酸保留，这可能会影响药物疗效或细胞通透性。

使用HER2+人胃癌细胞NCI-N87和HER2-人乳腺癌细胞MDA-MB-468的混合细胞群进行体外试验，与T-DM1相比，T-DXd不仅能杀死HER2+NCI-N87细胞，还能杀死邻近的HER2-MDA-MB-468细胞。异种移植实验验证了T-DXd在动物体内的旁观者效应。值得注意的是，T-DXd在与HER2+细胞接种部位不同的HER2-细胞中无效，这提示旁观者效应只能发挥 局部作用 。

Trastuzumab duocarmazine（SYD985），也在HER2异质性表达的细胞系中进行了评估。在仅含20% HER2+细胞的情况下，SYD985能杀死65%的混合细胞群，这提示它具有强大的旁观者效应，同样也在异种移植试验中得到验证。

目前，临床前模型中显示出旁观者效应的ADC，包括：戈沙妥珠单抗（SG）、tisotumab vedotin（TV）、enfortumab vedotin（EV）和anetumab ravtansine。anetumab ravtansine（BAY 94-9343）是一种新型ADC，通过可切割连接子和微管抑制剂DM4偶联。尽管DM4表现出与T-DM1相似的药理学和化学特性，但可切割连接子的存在证明了其具有膜渗透性的特征，且临床前研究已经证实该ADC的旁观者效应。

现有研究提示，ADC的旁观者效应与Ag+细胞比例成正比，并与抗原表达水平相关。另一个需要考虑因素是，从Ag+细胞内化ADC到释放载荷扩散到邻近细胞，即开始旁观者效应的时间。因此从理论上来说，随着Ag+细胞比例的降低，旁观者效应会随着时间的推移而减缓。在异质性肿瘤中，旁观者效应可以部分（但不是完全）补偿ADC的疗效受损。

二、旁观者效应的临床数据

T-DM1在HER2+（IHC 3+或2+ FISH检测阳性）乳腺癌中得到很好的证实。然而，T-DM1在HER2+胃癌、HER2+结直肠癌或其他组织学类型肿瘤中均未达到类似的生存改善。产生不同疗效的原因，人们提出了许多假设，例如：HER2作为肿瘤驱动因素所发挥的作用，不同类型细胞内代谢，以及HER2异质性和动态表达谱等。

T-DXd已获批用于HER2+转移性乳腺癌的治疗。基于DESTINY-Gastric01，T-DXd获批用于既往接受过曲妥珠单抗治疗的晚期HER2+胃癌。但是，结直肠癌DESTINY-CRC01（II期）显示，T-DXd在队列A（HER2+，IHC评分2 +或3+，FISH阳性）中具有良好的活性，而在队列B（IHC 2+，FISH阴性）和队列C（IHC 1+）中未观察到应答。

结合临床前数据，旁观者效应可以部分解释两种基于曲妥珠单抗ADC的临床活性差异。尤其针对胃癌，其HER2分布具有高度异质性。另一个例子是HER2低表达乳腺癌，T-DM1未显示出明确获益，而T-DXd显示出疗效。这可能是支持旁观者效应存在的主要临床论据。同时需要注意的是，载荷在目标肿瘤细胞附近的组织中扩散或进入血流可能增加毒性。事实上，与T-DM1相比，大多数新型ADC显示出更高的毒性。

然而，目前似乎没有确定细胞毒性载荷如何分配对靶抗原（Ag）阳性癌细胞的杀伤作用和旁观者效应的优先级，即载荷释放后直接杀伤靶细胞还是“跑出”细胞外，以及两者的分配比例。

三、旁观者效应在ADC疗效中占据怎样的地位？

旁观者效应在ADC的作用机制中发挥着重要作用，这可能是导致其适应症扩大的原因之一。但是，随着临床研究数据的增加，或给我们带来新的思考。

以采用与T-DXd相似设计的HER3-DXd为例，两款药物的主要差异是采用了靶向不同抗原的抗体，而连接子、载荷和DAR值都相同，或能更直观的感受旁观者效应的差异。同时，HER3-DXd所用的抗体已被证实单独使用未显示出临床活性，这也意味着所有药效将由细胞毒性药物和旁观者效应介导。

前面已经说到，理论上，ADC应该在Ag高表达肿瘤中叠加更强的旁观者效应，相对于中表达、低表达者应体现出更好的疗效。然而，在HER3-DXd治疗乳腺癌的临床研究中（NCT04699630），PART-A分析结果显示，治疗应答与HER3表达水平之间并未呈现正相关。当然，这项研究的患者人数较少，可能存在一定的局限性。该研究计划于2023年初步结束（Primary Completion），期待有更多数据公布。

此外，在U31402-A-J101（NCT02980341）研究，即便都是HER3高表达（注：低表达患者较少）的乳腺癌患者，HER3-DXd在不同组间仍出现了ORR、mPFS和OS的差异（下图）。

同样，ASCENT的研究结果也显示，TROP2表达水平并不能可靠地预测戈沙妥珠单抗的临床疗效。从总生存期（OS）数据来看，难以观察到临床疗效在TROP2高表达与中度表达患者之间的显著性差异。

旁观者效应的这种影响，或许很难通过科学的设计来增强。可以想象，如果想增强旁观者效应，势必要更多地向肿瘤周围环境中释放内吞降解后的游离载荷，加强了阳性靶标细胞的载荷外流。如此，如何保证对靶抗原阳性细胞的杀伤？如何控制“旁观者”细胞将载荷再次外排的速度？如果冒然增强载荷毒性以期提高旁观者效应，势必会影响药物的安全性。

近期发表的T-DXd临床II期DAISY研究，为我们呈现了基线背景相同的患者中，T-DXd在HER2不同表达水平和阴性患者中的临床结果，直接地呈现了T-DXd在HER2低表达与阴性患者中旁观者效应的增益价值。

DAISY研究是评估T-DXd对HER2过表达（n=72，队列1）、HER2低表达（n=74，队列2）和HER2阴性（n=40，队列3）转移性乳腺癌患者的临床疗效。结果分析显示，队列1中确认的ORR（主要终点）为70.6%、队列2为37.5%、队列3为29.7%。单纯从数字上来看，HER2过表达患者的mPFS更长、HER2低表达次之、HER2阴性最短。

这样的结果与我们对ADC的认知是相符的，HER2过表达理应相对于其他患者有更好的结局。但是，在DAISY研究中，T-DXd在HER2低表达和HER2阴性患者间，尽管队列2的ORR（P=0.30）和mPFS（adjusted HR=1.96）相对于队列3都显示了数值上的优势，但并未表现出统计学上的显著性差异。

理论上，HER2低表达患者肯定比HER2阴性患者中有更高的HER2表达，也更有利于旁观者效应的发挥。然而，相对于HER2阴性患者，HER2低表达患者并没有显著性的临床获益。具体来看，队列3中31例患者的基线活检获得的HER2染色显示，在15个样本中也检测到一定水平的HER2表达[ 8 个“超低”（ultra-low）和7个 IHC 1+（低表达）]，但相对于队列2并不占优势。其中，15个样本中，6例（40%, 95% CI 16.3–67.7）观察到了确认的客观缓解，这样的数据已经不逊色于HER2低表达的队列2（ORR：37.5%）。队列3中，这种“痕量”的HER2表达，能够介导什么强度的旁观者效应，令其与队列2的ORR相似？

还值得关注的是，在16例未检测到HER2表达的患者中，有4例（25%，95% CI 7.3–52.4）也观察到了确认的客观缓解。10例患者（27.0%）已经是队列3中主要的疗效人群（共11例患者显示PR），而4例活检染色也未检测出HER2表达的PR患者，也超越了ADC药物的认知范围，加之确认了ERBB2（编码含HER2蛋白的基因）的表达水平与疗效无关，表明可能存在部分药物功效通过非HER2依赖性机制介导，这种机制或许可以成为一种新的药物形式。

另外，可以看一下其他未显示出旁观者效应的新型ADC。例如ARX788，据文献描述，ARX788采用了非天然氨基酸的抗体偶联技术（注：在抗体中引入乙酰苯丙氨酸，并通过肟键与载荷准确连接），DAR约为2。这导致了一种高度稳定的化合物和严格控制的DAR。这种稳定性被认为可以减少循环中有效载荷的脱落，从而提高安全性和细胞毒性对癌细胞的递送。同时，这种设计防止了旁观者效应的诱导。尽管如此，该药在经过T-DM1治疗过的HER2阳性晚期乳腺癌患者中显示出有前景的活性，临床前数据提示它可能对HER2低表达的乳腺癌细胞也有活性。目前II期针对HER2低表达晚期乳腺癌的临床试验正在进行中（ACE-Breast-07，NCT05018676）。

综上所述，ADC是一类复杂的药物，其活性是由多种因素决定的。新型ADC临床试验的迅速增加有助于阐明旁观者效应发挥作用的大小，为下一代ADC的设计提供信息。 旁观者效应在ADC的整体疗效中占据怎样的地位？它是一个成功ADC普遍需要具备的特征？还是个性化ADC设计中的一个重要因素？您如何认为？

参考文献

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35305211/

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