Nature Biotechnol丨蛋白修饰测序有望类比 DNA测序？纳米孔改进型技术实现单肽单修饰高精度测试

撰文| 李淡宁

蛋白质翻译后修饰（Post-translational modifications,PTM） 参与了生理与病理过程；常见的蛋白质修饰包括磷酸化，乙酰化，甲基化，泛素化，糖基化等。准确测试各种修饰具有重要的生物学意义，尤其是高精度测试技术的开发将对人类的疾病判断与治疗至关重要。2021年Cees Dekker团队使用纳米孔测试技术，实现了单肽-单个氨基酸高精度测试【1】。那么何时能测试单肽-单修饰呢？

近日，荷兰代尔夫特理工大学，代尔夫特Kavli纳米科学研究所，生物纳米科学系Cees Dekker团队，在Nature Biotechnology杂志上，在线发表了题为Detection of phosphorylation post-translational modifications along single peptides with nanopores的文章，报道了纳米孔改进型技术，实现对单肽-单修饰的高精度测试。

为了满足科学研究，医学鉴定及治疗的需求。该团队基于2021年纳米孔技术实现单肽单个氨基酸测试的基础上，更近一步的对该技术进行改进，以实现单肽单修饰的高精准测试。本文研究人员首先使用不同linker在单肽两端分别连接了模版DNA与穿线DNA组成被检测的复合体; 利于DNA解旋酶hel308作为动力系统，MspA蛋白系统作为纳米孔并结合在生物膜上；在hel308的牵引下，被检测的复合体从膜的一侧，一步一步的，以分散的 （不连续） 步骤穿过纳米孔，因而阻碍离子流并产生可检测的电信号，每当通过一个分子基团便会产生一个步长 （step） 平缓的电信号；根据被检测复合体的分子基团，如碱基及化学基团，对离子流的影响情形便能推断出对应电子流信号为何种分子基团。如下图示：

紧随其后，研究人员使用免疫活性肽BCAR3 （氨基酸序列LKEPTRDMI） 及对其苏氨酸位点进行磷酸化的pBCAR3进行单肽单修饰测试。如下图上面部分显示，改进型的纳米孔检测信号灵敏度大幅提高，每一步信号输出平稳且步长间距明显，每个步长间差异明显。接下来，研究人员进行单肽单/双磷酸化修饰测试。他们使用临床相关的免疫活性肽βCAT (氨基酸序列AGSHIGSDLY) 作为测试目标，并在间距为3个氨基酸的2个相邻丝氨酸上进行相应的磷酸化。试验结果如下图下部分显示，结果与单肽单修饰一致，步长平缓，每个步长较长，步长间间距非常清晰。

总之，该团队研发的纳米孔单肽测试技术，无疑是一次技术飞跃，尤其是本文改进型的纳米孔技术，电信号图像更加清晰明了。尽管该技术依然面临很多困难，但随着不断改进，及对各种序列组合所产生的电信号图像数据，如信号曲线下面积，进行统计分析，将来对蛋白质的氨基酸序列进行测试也将变得跟DNA序列测试一样快捷可行。

原文连接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01839-z