土壤中不同水平的砷污染与哪些抗性相关？

文|认知百事

前言

砷被称为有毒的准金属，主要以无机形式存在，可以通过自然环境中的微生物氧化还原过程转化，毒性和流动性强得多，因此微生物砷氧化还原转化对砷的毒性和流动性有重大影响，从而极大地影响人体健康。

在研究中，3种不同砷污染土壤中微生物抗亚砷酸盐物种的分布和多样性，并进一步研究这些物种的抗性水平和相关功能基因。

土壤和水环境中的毒素砷被认为是世界上癌症死亡的主要环境原因之一，特别是在孟加拉国，印度和中国，近年来，长期摄入含高砷的地下水在中国多个省份引起了地方性砷中毒，并且砷中毒的新病例不断出现。

亚砷酸盐氧化细菌

开发高效环保的技术从土壤和水系统中去除砷对包括中国在内的许多国家都非常重要，重金属或有毒金属污染地点的生物修复通常被证明比化学和物理方法更有效，特别是在刺激本地微生物群落时。

细菌已经开发出不同的策略来转化砷，包括亚砷酸盐氧化、细胞质砷酸盐还原、呼吸砷酸盐还原和亚砷酸盐甲基化，其中一些转化的主要作用是应对砷毒性，亚砷酸盐氧化细菌将亚砷酸盐氧化为砷酸盐，在许多情况下，砷酸盐主要被认为是解毒代谢。

而且As（V）带负电，很容易被吸附，因此这种细菌已与固定材料一起用于间歇式反应器中，用于去除废水中的砷，已在各种细菌中鉴定出As氧化，包括假单胞菌，产碱，硫单胞菌，农杆菌和热菌。

其中一些细菌能够使用As（III）作为唯一的电子供体，并作为益石生物生长，然而表征的异养亚砷酸盐氧化细菌尚未被证明通过亚砷酸盐氧化获得能量，并且可能使用As氧化作为解毒机制，亚砷酸盐氧化是由周质亚砷酸氧化酶催化的。

该酶含有两个亚基，分别由基因aoxA/aroB/asoB（小Fe-S Rieske亚基）和aoxB/aroA/asoA（大Mo-pterin亚基），最近aoxB样序列已广泛存在于不同的砷污染土壤和水系统中，负责As挤出的两个亚砷酸转运蛋白家族ArsB和Acr3p已被证明具有抗砷性。

大肠杆菌的ArsB，已经被广泛表征，并被证明是一种45 kDa的内膜蛋白，具有12个跨膜螺旋，单独使用ArsB或与ArsA联合使用均可催化亚砷酸盐和锑酸盐从细胞中挤出，在大多数情况下，arsB与编码砷酸还原酶的arsC共同转录。

有人认为，ArsB和ArsC家族的进化和水平基因转移（HGT）可能在微生物进化中同时发生。在许多情况下，As（III）被水甘油通道蛋白吸收并被ArsB挤出，Acr3p转运蛋白的成员表现出与ArsB相似的功能，但这两种蛋白质没有显着的序列相似性。

尽管Acr3p的特征要少得多，但据报道，它存在于比ArsB更系统发育更远的物种中，根据系统发育差异，Acr3p可分为Acr3（1）p和Acr3（2）p两个亚科，Acr3p似乎更具特异性，仅运输亚砷酸盐而不运输锑酸盐，除了集胞藻的Acr3p能够运输亚砷酸盐和锑酸盐。

亚砷酸盐转运蛋白基因arsB和ACR3已在各种土壤细菌中鉴定出来， 然而基因型与亚砷酸盐抗性水平之间的相关性尚未被发现，微生物亚砷酸盐氧化和砷酸盐还原的影响会影响环境砷循环，了解砷污染地点本地细菌物种的多样性和分布对于改善砷生物修复可能很重要。

迄今为止，具有砷生物转化能力的微生物物种尚未在中国土壤系统中，不同砷污染水平土壤中抗亚砷酸盐和亚砷酸盐氧化细菌的分布和多样性;不同的亚砷酸氧化酶和亚砷酸转运蛋白基因，并尝试将它们的存在与这些细菌的抗砷水平相关联。

在58个菌株中，45个从高砷污染土壤中分离出来，8个从砷污染中间土壤中分离出来，5个从低砷污染土壤. 不动杆菌、代尔夫氏杆菌、关节杆菌、微杆菌、气单胞菌、酸酸杆菌、恩西弗、简杆菌、克雷伯氏菌、科库里亚、微球菌，鉴定出来的砷污染。

从TS和LY/YC站点鉴定出农杆菌，红球菌和芽孢杆菌，不动杆菌、假单胞菌、狭窄滋养单胞菌、代尔夫氏菌、农杆菌和芽孢杆菌是所有分析土壤样品中主要的亚砷酸盐抗性细菌。

亚砷酸盐氧化细菌在系统发育上很遥远

鉴定出8种亚砷酸氧化细菌，包括嗜铬杆菌属SY43（β-变形杆菌）、农杆菌属TS45、TS4、LY44，所有这些都是异养的，因为它们不能使用一氧化碳2作为唯一的碳源，也不能与亚砷酸盐作为唯一的电子供体一起生长。

分析了这些菌株的16S rDNA身份，并将其与以下相关的亚砷酸盐氧化细菌进行了比较。嗜铬杆菌属SY8与嗜铬杆菌属NT98共享16%的10S rDNA同一性，农杆菌属TS43，TS45，LY4分别显示出99%，98%和99%的16S rDNA身份与农杆菌属5A，TS16假单胞菌和恶臭假单胞菌菌株OS-44之间的5S rDNA一致性为97%。

亚砷酸盐耐药细菌的抗亚砷酸盐水平差异很大

58种菌株中亚砷酸盐的MIC范围为2 mM至34 mM。MIC值≥1 mM、≥ 2 mM、≥5 mM、≥10 mM、≥ 15 mM、≥ 20 mM和≥ 25 mM的菌株数量分别为30、58、48、33、25、17和5，发现亚砷酸盐抗性水平、细菌种类和具有不同砷污染水平的土壤之间存在一定的相关性：

属于厚壁菌的2种菌株均表现出非常低的MICs[芽孢杆菌属TS5（2 mM）、TS3（27 mM）、YC5（1 mM）、LY3（2 mM）和Exiguobacterium sp. LY3 （3 mM）

在属于假单胞菌或农杆菌的菌株中，亚砷酸盐氧化剂的MIC高于非亚砷酸盐氧化剂[TS3假单胞菌属与TS23假单胞菌属（5 mM）、TS9（9 mM）、SY6（4 mM）、SY5（6 mM）、SY3（7 mM）; TS7 （43 mM）、TS25 （45 mM）、LY20 （4 mM） 与 TS20 农杆菌属 （8 mM）

8种亚砷酸盐氧化剂（5毫米）的平均MIC高于20种非亚砷酸盐氧化剂（53毫米）共有12种高度耐亚砷酸盐细菌[不动杆菌属TS12、TS6、TS14和TS23、关节杆菌属TS42、TS22和TS37、红球菌属TS38、狭养单胞菌属TS21和TS15以及23种亚砷酸盐氧化剂 TS43的MIC超过44 mM仅从高度砷污染的TS土壤中获得。

从中度和低度砷污染土壤中只发现了中等和低中等收入的抗亚砷酸细菌， 高度受砷污染的TS地点的菌株具有更高的亚砷酸盐抗性水平（平均MIC = 10 mM），高于中间（平均MIC = 14 mM）和低砷土壤（平均MIC = 11 mM）的菌株。

亚砷酸氧化酶基因aoxB和亚砷酸转运蛋白基因的鉴定和分布

使用简并引物PCR从5株中成功扩增了51个亚砷酸氧化酶基因和38个亚砷酸转运蛋白基因，ACR3（1）和ACR3（2）仅在高和中砷污染土壤的菌株中扩增，相比之下，aoxB和arsB存在于从所有三种砷污染环境中分离的菌株中）.

同时含有亚砷酸氧化酶基因和亚砷酸盐转运蛋白基因的菌株的平均亚砷酸盐抗性水平高于仅具有亚砷酸转运蛋白基因的菌株，aoxB序列从所有五种亚砷酸盐氧化剂中扩增，没有从53种非亚砷酸盐氧化剂中的任何一种扩增aoxB序列。

TS44假单胞菌和产碱性产碱NCIB 8687之间的AoxBs的同一性仅为61%）. 16S rDNA与推导的AoxB系统发育树的比较表明，它们的进化关系相似。

使用BlastX算法对亚砷酸转运蛋白基因的分析显示，具有71%-80%a身份的蛋白质包含2个ArsB和6个Acr3（2）p，81%-90%a身份的蛋白质具有10个ArsB，5个Acr3（1）p和11个Acr3（2）p，ACR3和ACR3均从亚砷酸盐氧化剂和非亚砷酸盐氧化剂中扩增。

同时含有2个亚砷酸转运蛋白基因的菌株是SY7假单胞菌属 TS29、 TS12、TS30、TS33、TS41和SY4假单胞菌、狭养单胞菌属TS28、SY1、SY2、气单胞菌属TS26、TS36和TS44假单胞菌 ArsB、Acr3（1）p和Acr3（2）p的系统发育分析显示，Acr3p和ArsB簇明显分离. Acr3p簇进一步分为Acr3（1）p和Acr3（2）p两个系统发育组。

当比较16S rRNA基因与编码aoxB基因的系统发育时，亚砷酸氧化酶基因aoxB似乎是垂直转移的，相比之下在比较基于16S rRNA基因和亚砷酸转运蛋白基因的系统发育树时，出现了某些不一致，在8个ACR3（2）和1个arsB中可以检测到系统发育差异：

基于26S rDNA分析的属于γ-变形杆菌的气单胞菌属TS36，TS16被分配给基于Acr3p（2）序列的β-变形杆菌;（ii）使用28S rDNA分析将属于γ-变形杆菌的狭窄滋养单胞菌TS2，SY1，SY16分配给基于Acr3p（2）序列的α-变形杆菌。

TS32、TS35 和 TS33 被证明属于β-变形杆菌，但使用 Acr3（2）p 序列被分配到γ-变形杆菌分支;（iv）LY4属于基于16S rRNA基因的α-变形杆菌，但其ArsB属于γ-变形杆菌分支. 系统发育差异表明：

使用代表高、中、低、砷污染水平的四个土壤样品，TS土壤采集于位于中国中部湖北省黄石市的铁山区，这是一个高度砷污染的地区，有几种金属（金、铜、铁）矿山已经冶炼多年。

笔者认为

3种不同砷污染水平的土壤中微生物抗亚砷酸盐物种的分布和多样性，并进一步研究了这些物种的亚砷酸盐抗性和砷转化基因。我们的研究提供了负责亚砷酸盐氧化和抗性的微生物物种和基因的宝贵信息，并增加了对本地细菌多样性和分布的了解，这些细菌可能被刺激到砷污染的成功生物修复中。