Cell论文一作直播解读：抗体基因超突变的DNA柔性基础

2023年4月24日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心孟飞龙团队和上海交大医学院上海市免疫学研究所叶菱秀团队（博士生王燕燕为论文第一作者）在国际顶尖学术期刊Cell发表了题为：Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation 的研究长文（Research Article）。

该研究系统揭示了抗体基因互补决定区（CDR）偏好性突变背后的生化机制，特别是抗体基因编码序列DNA柔韧性的重要生理作用。这项研究解决了困扰免疫学家40多年的科学难题，为优化现有动物模型及推动下一代抗体基因人源化动物模型的发展提供了全新的见解。

图1：CDR区序列的柔韧性决定了偏好性突变

研究团队首先从经典的生化方法出发，建立了AID体外生化反应新方法，通过分析27种有颌脊椎动物的超1000条抗体重链基因序列的体外突变特征，发现CDR突变偏好在使用体细胞高频突变（SHM）作为主要抗体多样化策略的四足动物（包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鸭嘴兽以及羊驼等）中高度保守（图2），暗示了CDR突变偏好受DNA序列上下文的影响。

图2：CDR突变偏好具有进化保守性

随后，研究团队在体内进行了验证，将小鼠体内一段抗体基因DNA序列进行随机替换，发现新的序列环境显著改变了原始位点的突变频率。紧接着，研究团队进一步聚焦于一段CDR3序列，通过基因编辑快速获得携带不同CDR3上下文序列小鼠模型，发现序列改变对突变频率造成了不同程度的影响，并且序列改变越靠近AID的作用位点，对突变频率的影响越大。

为了深入挖掘DNA序列特征，研究团队结合分子动力学模拟及单分子荧光相关光谱实验证明了AID的靶向偏好受单链DNA底物柔韧性的直接调控，尤其是紧邻AID作用位点WRC（W=A/T，R=A/G）上游的6nt DNA序列组成。该位置富含嘧啶-嘧啶二核苷酸的柔性DNA序列（[-PyPy-]WRC）有利于结合AID，进而有助于突变的发生（图3）。

图3：柔性DNA序列更易结合AID

通过分析抗体基因序列特征以及突变谱式，该团队发现抗体可变区基因CDR编码序列在进化中获得了高度柔韧性特征。同时，AID也进化出了表面正电荷片区。这种酶和底物的协同进化促进了CDR偏好性突变的发生。最后，研究团队分别在B细胞系和小鼠体内将柔性DNA序列替换到低频突变区，成功地将该区域逆转为高频突变区（图4）。

图4：柔性序列将FR区逆转为类CDR区

综上所述，这项工作从经典的生化方法出发，联合高通量测序技术、分子动力学模拟以及单分子荧光相关光谱技术等多种研究手段，在生化、细胞和小鼠模型三个层面，以全新的角度全面揭示了DNA柔性调控抗体多样化的分子机制，并且该机制在许多物种中都普遍存在。该研究为DNA力学性质调控细胞生命活动提供了有力的实证，揭示了密码子也有非编码功能。

该研究对如何发展下一代抗体基因人源化动物模型以及加速罕见抗体的发现具有关键性的指导意义，因为现有抗体基因人源化小鼠模型均适用胚系抗体基因序列，大大限制了体细胞高频突变过程，这无疑限制了高亲和力抗体产生的速度。相信这种中尺度序列特征的发现为从头理性设计抗体基因，针对性解除限速步骤以及打造超级抗体提供了坚实的理论基础。