染色质环的堆叠参与基因组从拓扑结构域到染色质的折叠

撰文 | 风

2米长的DNA如何高度有序地折叠在10微米的细胞核内，并完成复杂的转录和复制过程是一个极其有趣的难题。起初，我们对于基因的认识是编码区和调控区的线性排列。随着技术的发展和研究的深入，我们发现基因组的三级结构精细调节DNA的空间排列，且与其功能相适应。基因组的三级结构可以分为不同层次结构单元，包括染色质疆域(Chromosome Territory，CT)，染色质区室(A/B compartments)，拓扑结构域 (Topologically associating Domains，TADs)，和染色质环 (chromatain loop) 等【1-3】。其中，TAD是基因组上频繁交互的染色质区域，它的一个重要功能是形成基因调控的独立区域，同时，将它们与邻近区域隔离开来【3】。大量的证据表明TAD的形成涉及多种架构蛋白 (arichitecture protein，AP) 的参与，例如CTCF和cohesin【4】。然而，在单个染色体的详细3D结构图谱以及在敲除CTCF或者cohesin时，从TADs到整个染色体水平上如何改变仍然不清楚。

近日，来自美国斯坦福大学的Alistair N. Boettiger团队在Molecular Cell上在线发表题为Loop stacking organizes genome folding from TADs to chromosomes的文章，揭示染色质环的堆叠对于基因组层面上的3D结构是重要的；CTCF参与TAD边界点的优先聚集，cohesin对于TADs到整个染色体的折叠都是必须的。

首先，研究人员使用生长素诱导的蛋白降解 (auxin inducible protein degradation)和染色质结构光学重建(optical reconstruction of chromatin architecture，ORCA) 技术观察小鼠胚胎干细胞 (mouse embryonic stem cells，mESCs) 3号和6号染色体在CTCF和RAD21 (cohesin的亚基) 敲除条件下的染色体变化。作者又开发了多重ORCA方法 (multiplexed ORCA approach) 缩短成像时间。同时又使用模拟实验说明TADs水平是基于持续和动态过程的群体特征，而不对应单个细胞的静态结构。另外，降维分析，例如t-SNE可能并不是在强调持续变化过程中 (例如分析单个染色质的折叠) 差异的理想工具。

随后，基于上述的实验方法，作者发现CTCF缺失时，loops示踪显示肉眼无差别。具体来看，CTCF缺失时，部分染色质区域增加的loops可以被其他区域减少的loops所平衡，且增加的loops主要在TADs之间的区域，而降低的loops在TADs区域。在cohesin缺失时，loops在TADs和TADs之间的区域均显著降低。同时，配合Geminin免疫荧光，作者发现在cohesin缺失时染色质的扩张并非是由于姐妹染色单体的连接的缺失而是染色质顺式结构的改变驱动的。

之后，作者发现染色质loops通常共享锚定点，使用multi-way contacts分析观察到CBSs (CTCF boundary sites)以及CBSs-proximal位点上的three-way contacts出现的频率在CTCF和cohesin敲除后均降低。另外，染色质趋向于组成一个以CBSs形成的中心放射状排列的结构，CTCF和cohesin敲除后，CBSs为中心的结构趋势降低。因此，loops锚定点之间的multi-way contacts需要CTCF和cohesin的维持。那么，是否CTCF和cohesin敲除引起的loops减少会在基因组层面改变染色质结构呢？答案是肯定的，通过设计不同尺度规模的探针，作者通过ORCA和模拟实验均发现cohesin介导的loop不仅对于TADs的产生很重要，对于整个染色质尺度上维持更有序的染色体结构同样十分重要。

作者引入熵的变化进一步量化基因组折叠过程中的紊乱。Cohesin敲除导致的熵增的染色质变化，而CTCF敲除则在-2.5Mb尺度上熵的变化很小，在-30Mb甚至整个染色体尺度上轻微改变。另外，FISH检测基因的表达发现，cohesin敲除后，基因表达的变异系数轻微增加。这些数据表明急性的cohesin敲除导致染色质结构的紊乱并伴随熵值增加的变化，同时细胞间基因的表达变异增加。

综上所述，作者再次提供强有力的证据表明CTCF和cohesin通过辅助染色质loops的形成和堆叠进而参与基因组的折叠。CTCF和cohesin的敲除将导致染色质的无序状态和熵增变化，影响基因的表达。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.04.008

制版人：十一

参考文献

1. Gabriele M, Brandão HB, Grosse-Holz S, Jha A, Dailey GM, Cattoglio C, Hsieh TS, Mirny L, Zechner C, Hansen AS. Dynamics of CTCF- and cohesin-mediated chromatin looping revealed by live-cell imaging.Science. 2022 Apr 29;376(6592):496-501.

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4. Oudelaar AM, Higgs DR. The relationship between genome structure and function.Nat Rev Genet. 2021 Mar;22(3):154-168.

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