专访李健丨上科大首次构建以赤藓糖醇为唯一生长碳源的大肠杆菌

由于倍增时间短、生长密度高、基因操作简单以及适合大规模发酵等优势，大肠杆菌在代谢工程和合成生物学中被广泛设计和应用，是生物制造中应用最多的宿主系统之一。

在实验室中，大肠杆菌的培养主要是基于易于使用的碳源，尤其是葡萄糖（C6）；也有很多研究改造大肠杆菌，使其以CO2、甲醇（C1）等为生长碳源。此外，科研人员还在尝试进一步拓展大肠杆菌能够利用碳源的范围。

近期，上海科技大学李健教授团队取得了重要进展，研究人员利用合成生物学及代谢工程等技术手段，将从自然环境中分离出来的赤藓糖醇代谢通路，在大肠杆菌中重构，得到了以赤藓糖醇（C4）为唯一生长碳源的大肠杆菌。这也是首次将大肠杆菌可利用碳源拓展至 C4。

相关文章以 “Engineering Escherichia coli to Utilize Erythritol as Sole Carbon Source” 为题发表于Advanced Science杂志，上海科技大学物质科学与技术学院 2021 级博士研究生巴方为论文第一作者，李健为通讯作者。

（来源：Advanced Science）

“这项工作将对合成生物学、代谢工程及生物医学工程等领域产生积极的影响，”李健告诉生辉 SynBio，“在合成生物学领域，研究中鉴定的赤藓糖醇代谢通路及其转录调控因子，可以作为新的标准化基因元件及基因线路；在代谢工程领域，通过赤藓糖醇代谢通路的体内重构，可以为合成相关高价值化合物提供充足的合成前体，进而提升其产量；在生物医学工程领域，通过改造治疗性益生菌，可以在特定病灶部位实现治疗等生物医学功能。”

缘起于无糖饮料，让大肠杆菌“吃代糖”

在 2021 年 5 月的一次国内学术会议上，很多学术报告的内容都集中在“双碳”目标上，李健和学生巴方（即文章的第一作者）也在讨论能否做些相关工作。

“正好他手上拿了一瓶无糖饮料，里面使用了一种代糖——赤藓糖醇——来提供甜味，结合研究方向，我们想到或许也存在微生物可以代谢利用赤藓糖醇。”

赤藓糖醇是一种天然的四碳（C4）糖醇，具有甜味，广泛存在于水果、蔬菜及发酵类食品中。因其物理化学性质稳定、价格便宜、生物安全性高，且不能被人体分解代谢吸收等特点，赤藓糖醇作为一种天然代糖被广泛运用于食品工业中（如作为无糖饮料中的代糖）。

回到实验室后，他们马上配制了以赤藓糖醇为唯一碳源的人工合成培养基，静置于空气中，尝试富集能够在此培养基中生长的微生物。约一周时间后，培养基开始变得比较浑浊。

▲图丨李健指导学生巴方进行实验（来源：受访者提供）

“很高兴，正如我们料想的，确实存在可以代谢利用赤藓糖醇的微生物。”

接下来，他们对液体培养基中的未知微生物进行分离鉴定，在该微生物基因组上发现了能够代谢赤藓糖醇的基因簇（即代谢通路），通过进一步分析，确定了该基因簇上参与赤藓糖醇催化代谢的五个酶蛋白。

“经由五步酶催化，可将赤藓糖醇代谢为终产物赤藓糖-4-磷酸（磷酸戊糖途径的中间产物），并经磷酸戊糖途径进入微生物的碳代谢网络，用于支撑微生物的生长。”

至此，为了获得能够代谢利用赤藓糖醇的大肠杆菌，研究人员将上述代谢通路重构至大肠杆菌体内。

然而，改造后的大肠杆菌虽然能够在合成培养基中以赤藓糖醇为唯一碳源进行生长，但是菌体生长较为缓慢。

▲图|工程化大肠杆菌利用赤藓糖醇为唯一碳源进行生长（来源：Advanced Science）

为了提升工程化大肠杆菌对赤藓糖醇的代谢能力，“我们对大肠杆菌生长过程中的转录组进行了分析，比较了菌株分别在以葡萄糖和赤藓糖醇为唯一碳源培养基中的转录水平差异。”

结果发现，催化赤藓糖-4-磷酸转化的下游四个相关酶基因的转录水平均有不同程度的提高，有的甚至提升了 6 倍。

▲图 | 大肠杆菌以葡萄糖和赤藓糖醇为唯一碳源生长时的代谢转录组对比分析（来源：Advanced Science）

“所以，我们又通过代谢工程手段，将菌株中的上述四个基因进行过表达，以提升催化赤藓糖-4-磷酸向下游糖代谢通路（如糖酵解）的转化效率。”

结果显示，经过进一步工程化的大肠杆菌对赤藓糖醇的利用率有了显著提升，也体现为菌株的生长速度的提升。

潜在应用广泛，将对多领域产生积极影响

在该研究中，李健等人共设计了两种工程化大肠杆菌菌株。

“大肠杆菌 MG1655 是模式菌株，Nissle1917 是肠道益生菌（有商品市售），工程化这两株大肠杆菌的技术手段是类似的，而且改造后都能以赤藓糖醇为碳源进行生长。”李健介绍道。

“选取它们的主要目的，一是为了验证赤藓糖醇代谢通路可以在不同大肠杆菌菌株内发挥功能，二是为了拓展未来对赤藓糖醇的应用场景。通过这两株菌株的成功构建，显示了改造更多不同类型大肠杆菌或者其他菌株/细胞利用赤藓糖醇的可能。”

在这项工作中，该团队还首次鉴定了受赤藓糖醇调控的转录调控因子 eryD 及其 DNA 结合位点，该结合序列位于赤藓糖醇代谢基因簇的启动子内部，并受不同浓度赤藓糖醇的调控。

“将此响应调控元件构建至其他基因线路中，也可以很好地调控下游基因的表达，并且调控元件（即 eryD 及其 DNA 结合位点）与赤藓糖醇有良好的正交性。因而，这一调控系统有望进一步被开发为合成生物学的基本元件，具有较广的潜在应用前景。

▲图 |赤藓糖醇转录调控元件/系统的鉴定及应用（来源：Advanced Science）

此外，赤藓糖醇代谢的终产物——赤藓糖-4-磷酸是芳香族氨基酸（如苯丙氨酸和酪氨酸）以及众高附加值化合物的上游前体物质。

“通过赤藓糖醇代谢通路的体内重构，可以快速将赤藓糖醇转化为赤藓糖-4-磷酸，为合成相关高价值化合物提供充足的合成前体，有望提升目标化合物的产量。”

在生物医学工程领域也有潜在应用。“活体菌群治疗是方向之一，可通过改造治疗性益生菌使其能够对赤藓糖醇以唯一碳源进行响应和利用，进而在特定病灶部位实现治疗等生物医学功能。”

其他应用还包括，开发工程化的大肠杆菌菌株为赤藓糖醇活体检测器，用于检测市售饮料中是否含有代糖（即赤藓糖醇）成分。

延续这项研究，团队正在开展的工作还是围绕合成生物学和代谢工程这两个方面进行的。“希望能够把赤藓糖醇代谢通路及其相关生物调控元件的应用场景给拓展开，发挥它们的应用价值。”李健说道。

写在最后

目前，李健团队的研究方向仍然集中在合成生物学领域，重点是无细胞合成生物学（cell-free synthetic biology），研究内容主要包括链霉菌无细胞蛋白合成体系的继续提升优化、天然产物的无细胞生物合成以及利用无细胞代谢工程实现高附加值化合物的生物转化。

2022 年，李健团队在ACS Synthetic Biology杂志上报道，链霉菌无细胞系统的蛋白表达产量达到 500 μg/mL 以上，“目前我们获得了比 2022 年报道体系更高的蛋白表达产量。”

同时，他们的研究方向也扩展至基于细胞体内的合成生物学研究，除本文介绍的研究外，近两年分别发表了一些比较有趣的研究，比如 2022 年发表在Nucleic Acids Research上的一项工作，团队借用“共生（symbiosis）”的概念，开发了基于丝氨酸整合酶（serine integrase）的合成生物学新技术，将丝氨酸整合酶、基因线路设计与合成生物学元件（biobricks）紧密结合，实现了对合成生物学相关元件的精准操控；通过对不同色素蛋白表达的调控，获得了一系列带有不同颜色的大肠杆菌，实现了给微生物穿“彩衣”。

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