中药药理-药学1区-浙大:揭示牛至可重塑肠道菌缓解溃疡性结肠炎机制

【摘要】本研究旨在通过分析结肠组织中盲肠内容物和代谢产物中的肠道微生物群，分析牛至（Herba Origani）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）的保护作用，并探讨其作用机制。牛至提取物粉（HOEP）减轻了DSS诱导的UC小鼠的结肠炎症状、结肠炎症和病理损伤，并修复了肠屏障功能。肠道菌群分析表明，HOEP通过增加肠道菌群的α多样性，恢复了DSS处理小鼠的肠道菌群失调，增加拟杆菌群的丰度并调节短链脂肪酸（SCFA），从而维持粘膜免疫和肠屏障。代谢组学分析表明，HOEP促进了胆汁酸的吸收，并调节了胆汁酸在肠道中的代谢，从而维持肠粘膜免疫稳态。此外，HOEP还可能通过磷脂酰肌醇信号系统调节肠道免疫系统。这些发现表明，HOEP通过重塑肠道微生物群来调节胆汁酸和SCFA代谢，对DSS诱导的溃疡小鼠具有很好的保护作用，并且HOEP具有治疗炎症性肠道疾病的潜力。

亮点：

1. HOEP 减轻了 DSS 诱导的 UC 小鼠的症状和结肠病理损伤；

2. HOEP改善DSS诱导的UC小鼠的结肠炎症反应；

3. HOEP修复DSS诱导的UC小鼠的肠屏障功能；

4. HOEP恢复了DSS诱导的小鼠肠道微生物群失调；

5. HOEP调节DSS诱导的UC小鼠的肠胆汁酸和SCFA代谢。

论文ID

原名：Herba Origani alleviated DSS-induced ulcerative colitis in mice through remolding gut microbiota to regulate bile acid and short-chain fatty acid metabolisms

译名：牛至通过重塑肠道菌群调节胆汁酸和短链脂肪酸代谢来缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：7.419

发表时间：2023.02

通讯作者：孙红祥

通讯作者单位：浙江大学

实验结果

1. HOEP减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎

我们建立DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，动物实验方案如图1A所示。模型（MC）组小鼠体重明显低于正常对照（NC）组。四种剂量的HOEP降低了DSS小鼠的体重损失，而在使用DSS处理的不同组之间没有显著差异（图1B）。MC组小鼠出现便血和便溏。HOEP处理组小鼠的DAI评分低于MC组（图1C）。与NC组相比，DSS导致小鼠结肠长度显著减少（P<0.001）。柳氮磺胺吡啶（SASP）和HOEP组小鼠的结肠长度显著长于MC组（P<0.01）（图1 D，E）。HOEP预处理显著且剂量依赖性地改善了DSS小鼠中炎性细胞的浸润，并降低了结肠组织的病理评分（P<0.001，图1 G，F）。总之，HOEP以剂量依赖的方式减轻了DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎。

图1 HOEP减轻了DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎

（A）实验设计。（B）小鼠体重变化的相对值。（C）小鼠疾病活动指数。（D）每组代表性结肠图。（E）结肠的长度。（F）结肠组织的代表性H&E染色切片。比例尺，100µm。（G）结肠组织学评分。数据表示为平均值±SD（n=5）。与模型（MC）组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001。与正常对照（NC）组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。SASP：柳氮磺胺吡啶（阳性对照）；HOEP：牛至提取物粉末。

2. HOEP改善DSS诱导的UC小鼠结肠炎症并修复肠屏障功能

我们通过ELISA检测结肠组织中IL-1β和TNF-α的水平，结果如图2A所示。HOEP显著降低IL-1β和TNF-α水平（P<0.01或P<0.001）。Western blotting检测肠紧密连接蛋白claudin1和occludin的表达。DSS显著降低结肠组织中claudin1和occludin的蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01），而HOEP显著逆转了这一趋势（P<0.05或P<0.001，图2 B，C）。这些数据表明，HOEP降低了DSS诱导的UC小鼠结肠组织中炎症因子水平并增强了屏障功能。

图2 HOEP改善DSS诱导的UC小鼠的结肠炎症并修复肠屏障功能

（A）ELISA检测结肠组织中IL-1β和TNF-α的水平（n=5）。（B，C）通过蛋白质印迹法测定结肠组织中claudin1和occludin的蛋白表达水平（n=3）。（B）代表性数字。（C）定量结果。数据表示为平均值±标准差。与模型对照（MC）组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001。与正常对照（NC）组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。PC：阳性对照；SASP：柳氮磺胺吡啶；HOEP：牛至提取物粉末。

3. HOEP可调节DSS所致小鼠肠道菌群失调

我们对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠盲肠内容物中的16S rRNA基因进行测序和分析。与NC组相比，DSS导致小鼠的Shannon指数（图3A）和Chao1指数（图3B）显著降低（P<0.01或P<0.001），表明DSS诱导的微生物群多样性降低。HOEP增强了DSS处理小鼠的这两个指标，而HOEP和MC组之间没有出现显著差异（图3A，B）。基于加权Unifrac距离矩阵，我们在NC、MC和HOEP组之间的PCoA中观察到明显的分离（图3C），表明DSS诱导的菌群组成发生了显著变化，并且HOEP给药后肠道微生物群组成发生了显著调节。我们计算了前15种细菌在群间门水平上的相对丰度，结果如图3D所示。拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门是肠道微生物的四个主要门。MC组的厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比率显著高于HOEP组（图3D）。HOEP还逆转了DSS处理小鼠中变形杆菌丰度的增加（图3D）。在属水平，DSS导致小鼠体内Tuzzerella、Escherichia Shigela、Coriobacteriae UCG-002、Anaerovorax和脱硫弧菌的丰度显著增加。然而，这种现象在HOEP处理后被逆转（图3E）。

为了确定各组之间的显著差异物种，我们进行了LEfSe分析，结果如图3F、G和表S3所示。从门到属共获得21个分类群，其中NC组有9个分类群、MC组有10个分类群以及HOEP组有2个分类群。NC组丰度差异最大的类群是Prevotellacee NK3B31 group、Lachnospiraceae UCG-006、Prevotellaee UCG-001和Ruminococceae；MC组丰度差异最大的是变形杆菌属、γ‐变形菌、Erysipelotrichales和Candidatus Arthromitus；以及HOEP组丰度差异最大的是红螺菌、α-变形杆菌。基于绿色基因数据库中注释的16S rRNA测序数据，我们使用PICRUSt软件预测已知微生物基因功能的组成。DSS在小鼠中诱导了柠檬酸盐循环–TCA循环、磷脂酰肌醇信号系统、初级胆汁酸生物合成和次级胆汁酸生物合成途径的改变（图3H）。HOEP调节了DSS诱导小鼠上述改变的紊乱（图3H）。

图3 HOEP调节DSS诱导的小鼠肠道微生物群失调

（A）α多样性shannon指数（n=3）。（B）α多样性Chao1指数（n=3）。（C）加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。（D）在门水平对各组的群落结构进行分析。（E）群体间显著差异物种的热图。（F）基于LDA评分的差异细菌分布直方图。（G）LEfSe分析产生的富集微生物群分支图。（H）PICRUSt预测的微生物基因功能。（I）HOEP绘制的20个不同属的Sankey图。与正常对照（NC）组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。MC：模型对照；HOEP：牛至提取物粉末。

为了减少算法对结果的影响，我们将Wilcoxon秩和检验用于计算MC和NC组之间以及HOEP和MC组之间的差异物种。结果表明，与NC组相比，DSS导致66个属存在显著差异（表S4），而与MC组相比，HOEP导致27个属变化（表S5）。如图S1所示，MC与NC和HOEP与MC之间有24个共享的差异属。进一步的分析表明，在去除通过ANOVA算法筛选的相同属（如假黄色单胞菌、Erysipelatoclostridium、Haliangium等）后，HOEP逆转了14个不同属（表S6）。为了更直观地显示HOEP对肠道微生物群的调节作用，我们将HOEP逆转的所有20个属放在Sankey图中，结果表明，在具有显著差异的菌株中，变形杆菌的变异丰度最大，其次是拟杆菌属、脱硫杆菌属和厚壁菌属（图3 I）。

4. HOEP调节DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的宿主代谢组学

为了发现HOEP诱导的潜在代谢产物和途径，我们使用UPLC-MS/MS对结肠组织进行了非靶向代谢组学分析，在三组样品中共鉴定出1565种代谢物。PCA显示了三组代谢谱的高度差异，以及组内样品的良好再现性（图4A）。MC和NC组（图4B，表S7）之间以及HOEP和MC组（图4C，表S8）之间的差异代谢物数量分别为73和64个。

NC和MC组之间差异代谢产物的聚类热图显示，DSS导致各种胆汁酸（如α-鼠胆酸、nutriacholic acid、脱氧胆酸和猪脱氧胆酸）的水平降低（图4D）。DSS还增加了小鼠结肠组织中四种磷脂酰乙醇胺（PE）和多种磷脂酰胆碱（PC）的水平。如图4E所示，HOEP显著下调DSS小鼠结肠组织中PI（20:3（8Z，11Z，14Z）/18:1（11Z））和6-酮-前列腺素F1a的水平，并上调胆绿素、nutriacholic acid、脱氧胆酸、熊胆酸、异猪脱氧胆酸、异熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸的水平。

为了研究HOEP诱导的DSS小鼠结肠组织中的潜在代谢途径，我们使用Metaboanlyst 5.0对不同代谢产物进行代谢途径分析。DSS诱导了代谢途径的变化，如初级胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、鞘脂代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（图4F）。HOEP下调DSS诱导的小鼠结肠组织中的上述代谢途径（图4 G）。值得注意的是，HOEP还上调了DSS小鼠结肠组织中的磷脂酰肌醇信号系统通路（图4 G）。

图4 HOEP调节DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的宿主代谢组学

（A）代谢物的主成分分析（PCA）。（B，C）不同代谢物的火山图：MC vs NC（B）和HOEP vs MC（C）。（D，E）不同代谢产物的热图：MC vs NC（D）和HOEP vs MC（E）。（F，G）不同代谢产物的代谢途径：MC vs NC（F）和HOEP vs MC（G）。（H）MC与NC以及HOEP与MC之间的共同差异代谢产物。（I）共同差异代谢产物的代谢途径。NC：正常对照；MC：模型；HOEP：牛至提取物粉末。

为了进一步研究HOEP对代谢产物的调节，我们使用Venn图来细化MC与NC以及HOEP与MC的共享差异代谢产物。结果显示共有15种共有的差异代谢物，其中大多数是胆汁酸（图4 H，表S9）。潜在途径分析表明，胆汁酸代谢是所有代谢途径中最重要的（图4 I）。

5. 代谢物与微生物群组成的相关性

我们使用Spearman相关分析确定DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠盲肠内容物中微生物群属与结肠组织中代谢物之间的潜在关联。如图5所示，PI（20:3（8Z，11Z，14Z）/18:1（11Z））与Escherichia-Shigella和Coriobacteriaceae UCG-002高度显著正相关（P<0.01）。熊果酸和nutriacholic acid与Blautia和Erysipelatoclostridium呈显著负相关（P<0.05）。异猪脱氧胆酸与脱硫弧菌和Tuzzerella呈显著负相关（P<0.05）。DSS处理后，熊胆酸、nutriacholic acid和异猪脱氧胆酸的浓度降低，施用HOEP后浓度升高，与Blautia、Erysipelatoclostridium、脱硫弧菌和Tuzzerella的变化趋势完全相反。

图5 DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠代谢产物和微生物群组成之间相关性的热图

*P<0.05和**P<0.01。

IBD的发展与肠道微生物群的失调密切相关，肠道微生物群在调节肠道代谢产物中起着重要作用。在本研究中，我们对盲肠内容物进行16S rRNA序列分析和结肠组织的代谢组学分析，以探讨HOEP对DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎的作用机制。HOEP通过调节肠道微生物群落结构和结肠组织代谢减轻DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎。

我们在DSS治疗小鼠的结肠组织中观察到显著的体重减轻（图1B）、DAI指数增加（图1C）、结肠长度缩短（图1D、E）、炎性细胞浸润增加（图1F）和病理评分增加（图1G），表明本研究中建立的UC小鼠模型是成功的。HOEP可以剂量依赖性方式保护DSS小鼠免于溃疡性结肠炎相关症状（图1 B−G）。

IL-1β和TNF-α是与IBD发病相关的主要促炎细胞因子。除了促进炎症外，IL-1β和TNF-α还导致肠通透性增加。肠上皮紧密连接（TJ）是顶端连接，起到细胞间屏障的作用，防止细菌抗原和其他有害物质在肠腔中的细胞旁渗透。紧密连接的结构包括连接粘附分子，如claudin、zonula occludens和occludin。HOEP不仅以剂量依赖的方式显著降低IL-1β和TNF-α的水平（图2A），而且上调DSS小鼠结肠组织中occludin和claudin1的蛋白表达（图2B，C）。这些结果表明，HOEP减轻了DSS诱导的小鼠的炎症，并保护其免受结肠组织肠屏障功能受损的影响。

肠道微生物群失调已被认为是UC的重要致病因素之一。几项研究记录了IBD患者和健康个体肠道微生物群组成的差异，特别是在微生物多样性和特定细菌类群的相对丰度方面。DSS诱导小鼠肠道微生物的α多样性显著降低，这通过HOEP得到改善（图3A，B）。厚壁菌门和拟杆菌门是肠道中的优势菌群，占肠道微生物群的90%。F/B比值被广泛认为对维持正常肠道内稳态有重要影响。DSS增加了小鼠的F/B比率，而HOEP降低了DSS诱导UC小鼠的F/B比率，这表明HOEP调节了DSS诱导小鼠的肠道微生物群失调。同时，DSS导致小鼠盲肠中拟杆菌的丰度降低，而HOEP逆转了拟杆菌（如Prevotellacee Ga6A1 group）的趋势（图3D）（表S6）。拟杆菌主要产生乙酸盐和丙酸盐，它们是结肠中的主要SCFAs。SCFA诱导先天性淋巴细胞（ILCs）和CD4 T细胞产生IL-22，这对维持肠粘膜免疫至关重要。此外，乙酸盐可以通过GPR43信号通路介导抗炎作用。丙酸盐抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），后者抑制转录因子的表达，以抑制树突状细胞（DC）的分化和功能。此外，SCFAs增强紧密连接蛋白的表达并维持肠屏障。因此，我们推测HOEP通过增加拟杆菌的丰度来促进结肠中SCFA的产生，从而减轻DSS引起的肠道炎症和屏障损伤。

HOEP还降低了DSS诱导的小鼠中Escherichia-Shigella（变形杆菌）、Coriobacteriaceae UCG-002（放线杆菌）、脱硫弧菌（Desulfobacterota）（图3E）和Erysipelatoclostridium（厚壁菌）（表S6）的丰度增加。Escherichia-Shigella、Coriobacteriaceae UCG-002和脱硫弧菌可促进肠道炎症和上皮通透性。Escherichia-Shigella是一种变形杆菌，通过穿透上皮细胞致使巨噬细胞凋亡，并释放IL-1β来诱导肠道炎症。Coriobacteriaceae UCG-002属于红蝽菌科，产生苯酚和对甲酚，这两种物质都具有细胞毒性并降低肠屏障功能。我们在IBD患者的粪便中经常检测到脱硫弧菌，它通过降解半胱氨酸、还原异化硫酸盐而产生硫化氢（H2S）。结肠中高浓度的H2S抑制丁酸盐的氧化，研究已经表明IBD的发展与H2S浓度之间存在相关性。高浓度的H2S也增强了结肠上皮的通透性。Erysipelatoclostridium属于Erysipelatoclostridiaceae，与结肠疾病相关，是一种潜在的病原体，在患有IBD的小鼠中，其丰度显著增加，与TNF-α水平呈正相关，这与我们的趋势一致。DSS上调Filifactor（厚壁菌科），HOEP组下调（表S6）。值得注意的是，Filifactor以前与牙周炎有关。此外，Haliangium（Myxococcota）、脱硫菌属（Desulfobacterota）、SJA-15（Chloroflexi）、NS11–12 marine group（拟杆菌科）、Oryzihumus（放线菌属）和Hamadaea（放线杆菌属）等与Filifactor（表S6）具有相同的趋势，但在IBD中没有被报道过，其功能仍不清楚。因此，HOEP可能通过减少Escherichia--Shigella、Coriobacteriaceae UCG-002、脱硫弧菌和Erysipelatoclostridium的丰度来修复结肠上皮的屏障功能损伤，缓解DSS引起的结肠炎症。

来自肠道微生物的代谢产物是微生物群和宿主之间的关键分子介质。胆汁酸（BA）由胆固醇在肝细胞中合成，并通过经典和替代途径产生初级胆汁酸（PBA），包括胆酸和鹅脱氧胆酸。PBAs与牛磺酸和甘氨酸结合后进入肠道，然后通过微生物作用转化为次级胆汁酸（SBAs）。在本研究中，DSS显著降低了次级胆汁酸（包括熊胆酸、猪胆酸、猪脱氧胆酸、脱氧胆酸和异熊脱氧胆酸）以及初级胆汁酸鹅脱氧胆酸的水平（表S7）。IBD患者胆汁酸吸收不良，粪便中BAs水平升高。鉴于本研究中测试的样本是结肠组织而非粪便，这一现象与结肠炎的胆汁酸吸收减少以及厚壁菌门和拟杆菌门群落的结构变化有关。DSS诱导小鼠中熊胆酸、脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、异熊脱氧胆酸和猪胆酸的浓度降低，而HOEP可显著逆转这一现象（表S9）。BA信号是肠道完整性、微生物群和炎症的重要调节因子。BA代谢物可以通过细胞内位点调控T细胞分化并扰乱巨噬细胞极化。BAs的缺乏导致粘膜免疫紊乱，炎症加剧。这些发现表明，HOEP通过调节结肠中BAs的水平来维持肠道免疫稳态，从而减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。

Metaboanalyst和PICRUSt预测胆汁酸代谢和磷脂酰肌醇信号在潜在代谢途径和微生物基因功能中都出现。因此，我们假设HOEP也可能通过磷脂酰肌醇信号系统调节肠粘膜免疫稳态，而这需要进一步研究。

图6 Figdraw提出了HOEP对DSS诱导的小鼠UC的保护作用机制

结论

这项研究表明，HOEP减轻了DSS诱导的UC小鼠的结肠炎症状，改善了结肠炎症并修复了肠屏障功能损伤。我们还发现HOEP通过增加肠道微生物群的α多样性、提高拟杆菌门的丰度和调节SCFA的浓度，恢复了DSS诱导的小鼠肠道微生物群失调，以维持粘膜免疫和肠道屏障。此外，HOEP增加了DSS小鼠结肠组织中的胆汁酸吸收并调节了胆汁酸代谢，从而维持了肠粘膜免疫稳态。这些发现表明，HOEP通过重塑肠道微生物群来调节胆汁酸和SCFA代谢，对DSS诱导的溃疡性小鼠具有良好的保护作用（图6），并且HOEP有潜力用于治疗炎症性肠道疾病。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36822021/

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