活体成像做了几个月没结果，原来忽略了这几个要点

新来的师弟小鼠活体成像做了 2 个月，还没有结果，组会又成了老板的火力集中点。直到帮师弟分析实验才发现，原来师弟根本不会做活体成像。

师弟

师兄，组会又被老板骂了，我做的小鼠活体成像效果很差，你能帮忙分析下吗？

你在成像过程中，像素被饱和了，报告的信号亮度值出错。而且你用的 C57 小鼠都没有脱毛，怎么可能有好的成像结果？

师兄

师弟

我都没想到还有这些操作，怪不得这么久都做不出来。

其实小鼠的活体成像并不难，你只是原理还不够清楚，有的因素没有考虑进去才会导致结果不尽人意。我以前做实验归纳过一些实验技巧和注意事项，我把实验记录本给你，再好好研究下吧！

师兄

活体动物体内光学成像（Optical in vivo Imaging），常用的是生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶基因标记 DNA，利用其产生的蛋白酶与相应的底物荧光素发生反应，产生体内的光信号。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP 等）进行标记。

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在正式实验时，一些因素对实验最终结果影响很大。需要注意包括：底物的注射方式、动物毛发以及建立生物发光信号的动力学曲线等因素。

底物的注射方式

不同的底物注射方式，会对生物发光造成不同的影响。例如，D-荧光素可通过尾静脉注射（IV）或腹腔注射（IP）；而腔肠素会被血液中的氧气氧化，产生高背景荧光，所以只能通过尾静脉注射到动物体内。

腹腔注射和尾静脉注射的优缺点：

腹腔注射

（1）腹腔注射需要从腹膜腔吸收到血液；

（2）迅速分布全身，并穿过血液组织屏障；

（3）峰值时间较长，有较长检测窗口；

（4）60 分钟内逐渐减少，代谢较慢。

尾静脉注射

（1）与腹腔注射相比，尾静脉注射难度更大；

（2）可提供更好的重复性和敏感性；

（3）峰值时间较短；

（4）代谢快。

动物毛发

深色的动物毛发和皮肤色素是活体成像中的一个重要变量，特别是当需要对小信号变化或动物之间的差异检测时。所以，尽可能使用无毛或白化的动物品系。

建议：可以在成像前一天通过剃毛或化学脱毛来去除观察区域的毛发，以便最大限度地收集信号。

动物饲料

常规啮齿动物饲料中含有大量的紫花苜蓿，苜蓿中含有叶绿素。由于叶绿素及其代谢物聚集在肠道中，因此在小鼠腹部能够观察到较强的自发荧光，峰值波长约为 680 nm。肠道的自发荧光可能会掩盖定位于腹部或腹部附近的荧光探针的信号，也可能模拟探针在肠道中的排泄和/或积累。

建议：使用无苜蓿饲料，特别是纯化饲料，可以迅速减少肠道自身荧光，提高荧光成像信噪比。

建立生物发光信号的动力学曲线

生物发光信号强度反映的是荧光素酶底物随着时间推移的动态变化。实验观察底物在何时达到峰值。通常，成像开始于注射后，每 5 分钟重复一次，并在信号强度开始下降时结束。建立发光动力学曲线，确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟，然后将此时间用于后续实验，以标准化成像数据。

注意清洁实验动物和仪器

此外，动物垫料、食物和皮屑都可以产生背景荧光信号。所以在成像之前，用 70% 酒精浸湿纸巾，擦拭动物口鼻、爪子和排尿处，并清洁成像平台。

最后，生物发光所需的酶底物因荧光素酶的类型而不同。为了帮助大家在不同条件下的实验选择，以下为大家整理了常用荧光素酶信息表：

（点击查看大图）

当然，活体成像需要掌握的技术要点还有很多，其应用范围也不仅限于此。

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内容策划：潘成
内容审核：钟可可

题图来源：图虫创意