结合合成生物学开发基于蓝藻的新生物材料的进展与展望

与真核微藻相比，蓝藻有其独特的优势，包括最快的光合生长速率、较小的基因组、缺乏亚细胞组织，并且没有表观遗传基因沉默，因此，蓝藻更容易进行基因操作，已开发的遗传和计算工具也比微藻多。

蓝藻具有碳捕获潜力，是发展生物 CCUS 技术的主要候选者；它还比用于生物生产的传统微生物更具可持续性。许多材料科学家已经在开发基于蓝藻的生物材料方面取得了进展，并将其应用于碳捕获、建筑、能源和食品生产。

目前，一些生产基于蓝藻产品的企业已经达到了商业规模，例如使用基因工程蓝藻生产食用染料和调味品的Spira；使用生物矿化蓝藻制造混凝土砌块的Prometheus Materials；使用蓝藻递送治疗分子的生物药物公司Lumen Bioscience，还有从蓝藻中提取工业生物化学品的Photanol公司。

近日，一篇发表于Materials Today Bio的综述总结了利用合成生物学开发基于蓝藻的活生物材料的现状与展望，相关文章题为“Light and carbon: Synthetic biology toward new cyanobacteria-based living biomaterials”。

（来源：Materials Today Bio）

三个案例研究，基于工程蓝藻的生物材料

生物材料一：生物混凝土。

聚球菌诱导CaCO3的生物矿化，因为它们在光合作用时自然地提高了细胞外环境的 pH 值。这种自发的CaCO3沉淀被用于结合沙子-水凝胶基质，从而形成“生物混凝土”。

生物混凝土可以在不同的模具中铸造，生物成分可以再生三代。在将一块砖分成两半后，如果添加额外的非生物材料，另一半砖又会长回来。

然而，现有的材料需要进行优化，以便与传统的水泥竞争。具体来说，该材料的抗拉强度可以通过进一步增加CaCO3的沉淀来改善。实现这一点的潜在方法是使用碳酸酐酶，这是一种促进CaCO3沉淀的常见酶。

工程蓝藻分泌碳酸酐酶或在外膜上显示该酶，可促进水凝胶基质中的额外结晶，加强材料。

目前材料生产方法的另一个问题是，聚球菌需要较高的水分含量才能保持再生活力（相对湿度为 50-100%）。

针对这一问题，可以将某些丝状蓝藻中已被鉴定与抗干燥性相关的基因引入聚球菌中，帮助它在水泥中存活更长时间。此外，还可以将由外部刺激（如红光或污染物）诱导的遗传因子纳入蓝藻中，有助于开发一种能够感知环境并对环境做出反应的“智能”生物混凝土。

▲图丨现有的三种基于蓝藻的生物材料的图像：生物混凝土，碳捕获生物复合材料和生物光伏（来源：Materials Today Bio）

生物材料二：用于碳捕获的生物复合材料。

鉴于蓝藻无与伦比的光合效率，已经有许多开发蓝藻培养系统的碳封存的尝试。

一种新型的碳捕获生物复合材料已经被设计出来，它使用生物乳胶粘合剂将蓝藻包裹在丝瓜海绵支架上。丝瓜的多孔性，即干燥的丝瓜果实，使其具有较大的高表面，为蓝细菌的光合作用提供良好的通气性。

这种生物复合材料固定碳的效率高、污染少、用水少。若把系统中使用的野生型菌株替换成一种经过设计能将二氧化碳转化为有用的生物产品的菌株，该生物复合材料将在商业上可行。

另外，如果工程蓝藻可以利用固定碳促进生物矿化或合成不易生物降解的难降解生物聚合物，则该系统可适用于长期碳封存和储存。

不过，这种生物复合材料的一个问题是粘附力减弱，几周后一些细胞从粘合剂中流失到生长介质中，这会降低生物复合材料的碳固定效率。一个潜在的解决方案是使用自然形成生物膜的蓝藻，或者在聚球菌中设计细胞外聚合物质（EPS）的分泌来促进粘附。

生物材料三：生物光电技术。

在生物膜中，某些蓝藻在光合作用时将电子转移到膜上，产生光电流。

当生物膜生长在电极上时，这种光电流可以被“收获”。目前，已有 3D 打印电极柱制成，以有效地利用来自Synechocystissp. PCC 6803 或Nostoc punctiformme生物膜的光电流。

研究者使用气溶胶喷射打印方法，用氧化铟锡颗粒 "墨水 "打印出一个新颖的分支支柱结构，使光和电解质渗透到整个过程。其获得的光电流输出是半人工光合作用系统中报道的最高的，与现有生物燃料系统的效率相媲美。

为了扩大这项技术的规模，使其与其他能源竞争，需要改进这些材料中的电子转移。目前，在对外膜蛋白进行基因编码以增强细胞外电子转移和结合碳纳米管等非生物材料来改善功能方面，已经展开了一些工作。

蓝藻合成生物学的部分发展现状

蓝藻门由 6000 多个物种组成，它们具有不同的表型和自然环境。所有的蓝藻都是革兰氏阴性菌，能够进行产氧光合作用，但它们在其他特征上差异很大。

到目前为止，这些物种中只有少数被开发为合成生物学目标。

传统的模型菌株包括Synechococcus elongatusPCC 7942、Synechococcus elongatusPCC 7002、Synechocystissp. 6803。此外，Anabaenasp. PCC 7120 已被普遍用作丝状固氮蓝藻的模型。

▲图丨常见蓝藻菌株的特征（来源：Materials Today Bio）

而目前尚未被开发为模式菌株的蓝藻，如原绿球藻属（Prochlorococcus），实际具有很大的潜力。

原绿球藻是地球上最丰富的蓝藻，它们在生物碳泵中发挥着重要作用，并且是海洋生态系统中的主要生产者。它们的基因组也是所有光合生物中最小的，由此成为研究“基因组减少作为优化生物技术策略”的有趣模型。

然而，经过十多年的工作，在开发操纵原绿球藻的工具方面进展甚微。这是由于它们加倍时间极慢，对污染和生长条件敏感，对转化方法有抵抗力。

对于蓝藻来说，生长速度、多倍体特性等是阻碍其发展为优质模式生物的重要因素。

首先，在选择底盘时，生长速度是必须要纳入考虑范畴的一个重要因素。因为大多数模式蓝藻的数量翻倍时间为 7-15 小时，因此很难快速建立实验原型。

最近，研究人员发现了几种能够每 2 小时数量翻倍的蓝藻，该速度可与酿酒酵母相媲美，包括Synechococcus elongatusUTEX 2973 、Synechococcus elongatusPCC 11901, 以及Synechococcus elongatusPCC 11801 和 PCC 11802 ，这将使得蓝藻合成生物学中 “设计-建造-测试-学习”的周期大大加快。

其次，多倍体（在一个细胞中拥有多个基因组拷贝）是蓝藻的一个共同特征，大多数物种每个细胞拥有 3 至 200 个基因组拷贝。

多倍体的功能与增强抗压能力和增加代谢输出有关 ，但对于基因工程来说，具有许多基因组拷贝的细胞要花费更多的时间，因为它需要重复选择步骤，以获得在每个基因组拷贝中都具有所需编辑的纯合子菌株。

目前，针对蓝藻的多倍体特性，替代性基因编辑方法已取得进展。

另外，耐盐性也是一个值得继续开发的特性，因为大规模的蓝藻生长需要大量的水。这可以通过使用海洋菌株作为底盘来解决，或者通过优化淡水菌株来耐受高盐度(通过参与离子运输和分子伴侣的蛋白质的过表达)来解决。

因此，扩展蓝藻工程工具箱则十分必要。

在标准化生物部件方面，启动子是控制下游基因表达的生物部分，蓝藻中使用的许多启动子都改编自大肠杆菌的广泛启动子库。然而，启动子功能在不同物种之间往往是不同的，因此需要开发已经在多个菌株上测试过的蓝藻启动子库。

▲图丨合成生物学工具的示意图，使开发蓝藻为基础的生物材料从实验室原型到工业规模的材料（来源：Materials Today Bio）

在基因组工程方面，CRISPR-Cas9 是一种很有前途的蓝藻基因组编辑工具，它可以同时编辑多个基因，而且它在基因组目标位点造成的双链断裂对细胞是有毒的，提供了一种反选择策略，使分离过程更快。

CRISPR 用于蓝藻的工具正处于早期开发阶段；CRISPR-Cas9 已经成功用于提高 Synechococcus elongatus PCC 7942 的琥珀酸产量和 Synechococcus elongatus UTEX 2973 的游离脂肪酸产量。

然而，高水平的 Cas9 蛋白对大多数蓝藻是有毒的。另一种核酸内切酶 Cas12a 已成功用于Synechococcus elongatusUTEX 2973、Synechocystissp. PCC 6803 和Anabaenasp. PCC 7120，尽管编辑效率通常低于其他细菌的类似系统。

▲图丨转录单位和质粒类型（来源：Materials Today Bio）

最近，在Synechocystissp. PCC 6803 中建立了一种可诱导的基于核糖体开关的 CRISPR/Cas9 系统，严格控制 Cas9 表达的能力使编辑效率可靠。

CRISPR 干扰（CRISPRi）是另一种 CRISPR 相关技术，已被应用于几种蓝藻，包括Synechocystissp. PCC 6803[98]、Synechococcus elongatusPCC 7942 和Anabaenasp. PCC 7120。

另外，随着基因组测序、代谢工程的计算模拟等技术的发展，都将为开发新的模式蓝藻提供有力工具。

蓝藻合成生物学未来的发展方向

第一，蓝藻工程工具箱的扩展。

定向进化（DE）是一个利用进化来创造优化或新颖生物功能的过程。为了简化这一过程，已开发出连续 DE 技术如 PACE（噬菌体辅助连续进化），可在体内快速完成突变/选择周期。

未来，或许像 eVOLVER 这样的高通量培养平台（在酵母培养中自动化配种、温度控制、搅拌、稀释和清洗）可以用于蓝藻，来进一步自动化连续 DE 过程。

此外，目前用于定向进化的诱变技术（容易出错的 PCR 和化学诱变）在单个基因内或整个基因组中产生点突变。转座子诱变可以实现更大规模的突变：整个基因的敲除或激活自然沉默的基因。

目前已有研究证明转座子诱变可以在蓝藻中发挥作用，转座子测序（TnSeq）技术被用来快速筛选Synechococcus elongatusPCC 7942 的必需和非必需基因，以及丰富代谢的模型。

合理的基因组工程技术也需要扩展，目前一种初步的噬藻体基因工程方法已被开发。

第二，细胞内生物材料。

蓝藻有由蛋白质外壳组成的微室，围绕着具有特定功能的酶，就像真核细胞中的细胞器一样。其中两个微区室，羧基体和气体囊泡，是生物技术应用的强有力的候选者。

羧体使蓝藻能够有效地固碳，若将羧体引入植物叶绿体，则可能会改善植物的碳固定。最近，一组最小的 4 个羧基体基因被插入烟草后成功地产生了简化的羧基体结构。

气囊让蓝藻可以在水柱中垂直移动。最近有研究发现，从蓝藻中纯化的囊泡可以散射声音，使它们成为非侵入性超声成像的候选造影剂。

针对在医疗设备中使用纯化的蓝藻气囊作为超声波和核磁共振成像的稳定高造影剂，已经有了初步研究。

此外，最近的一项体内研究表明，气体囊泡在活的哺乳动物宿主中具有跟踪微生物细胞位置的潜力。对蓝藻进行工程改造，以调节它们对特定刺激的气囊的产生，可以使生物材料具有响应性浮力。

▲图丨蓝藻生物材料未来发展方向示意图（来源：Materials Today Bio）

第三，全球碳循环工程。

在遥远的未来，我们甚至可以利用蓝藻改变生物地球化学循环，以在全球范围内对抗大气中的二氧化碳不平衡。