FSHW | 烘烤对花生Ara h 3致敏性的影响及机理研究

Introduction

本文采用150 ℃烘烤20 min的加工方式对生花生进行处理，通过观察生花生和烘烤花生致敏的BALB/c小鼠的病理性指标，研究烘烤对花生粗提蛋白致敏性的影响；纯化得到花生主要过敏原Ara h 3，通过树突细胞研究Ara h 3致敏性改变的机理。结果表明，BALB/c小鼠病理性切片说明烘烤花生导致小鼠的空肠和肺部支气管破损程度增加、支气管周围的炎性细胞浸润现象增多；测定小鼠血清的免疫因子含量发现灌胃烘烤花生小鼠组的Th2型细胞因子分泌增加。花生烘烤后Ara h 3蛋白与IgE、IgG的结合能力增强；流式细胞仪检测显示，与生花生Ara h 3蛋白相比，相同孵育时间内树突细胞通过清道夫受体摄取了更多的烘烤花生Ara h 3蛋白；花生烘烤后Ara h 3发生糖基化反应，二三级结构改变。综上所述，烘烤花生Ara h 3蛋白发生糖基化和结构变化，促使树突细胞对其摄取增多，与IgE、IgG的结合能力增强，是烘烤处理增加花生致敏性的主要原因之一。本研究对花生脱敏技术的研究提供了新思路。

花生富含蛋白质，矿物质和多不饱和脂肪，已被证明有利于心血管健康和促进新陈代谢，因此近年来花生消费量不断增加。中国、印度和美国是最大的花生种植国家，2014年，美国对花生的人均消费量为3.2 kg。然而，花生是美国和欧洲最严重的食物过敏之一，且花生过敏具有持久性，致命性和不可治愈性，约有1.3%的美国人受到花生过敏的影响。对于易感人群，仅需0.4 mg的花生就可以引发过敏症状。截至目前，已有17种花生过敏原被正式注册并命名为Ara h 1～Ara h 17。其中，Ara h 3是花生的主要过敏原之一，大约占花生总蛋白质的30%，属于cupins超家族。Ara h 3在天然状态下是一个分子量达到400 kDa以上的六聚体蛋白聚合物，通过蛋白质加工变性可在SDS-PAGE上观察到Ara h 3的4条主要条带：42～45 kDa酸性亚基和25 kDa碱性亚基。

每个国家会根据烹饪传统对花生进行不同的加工处理，以改善感官特性，或加工成花生制品。例如烘烤、煮沸或油炸等热加工方法经常应用于花生的加工处理。花生的主要成分是蛋白质、糖、脂肪等物质，不同处理可以导致花生中不同成分间的各种生物化学反应，如美拉德反应，通过还原糖修饰蛋白质的氨基促使蛋白糖基化，这类蛋白质统称为晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）。西方国家如美国和欧洲的消费者喜欢食用烘烤花生，在烘烤过程中，花生蛋白会发生结构和化学变化，包括蛋白质变性、聚集和溶解度降低。在分子水平上，与生花生、煮花生或炒花生相比，研究已经证实烘烤花生过敏原在过敏反应的诱导阶段，具有更高的结合花生过敏患者血清中花生特异性IgE的能力。

为了阐明烘烤花生过敏原Ara h 3对于在过敏反应中的作用，我们研究了花生经过烘烤处理后，过敏原Ara h 3结构和物理化学性质的变化，并证明了树突细胞表面特异性受体对烘烤花生的Ara h 3的识别与摄取增加。该研究对于明确花生过敏机制及开发新的脱敏技术和方法提供了依据。

Results and Discussion

检测小鼠血清中细胞因子 IL-5、IL-13和MCP-1，炎性介质组胺，特异性抗体IgE、IgG1和IgG2a的含量（图1）。结果表明，烘烤花生致敏的小鼠血清中Th2型细胞因子（IL-5、IL-13）含量均显著高于生花生组小鼠，表明烘烤花生具有更强的引发小鼠体内Th2型过敏反应。烘烤花生致敏的小鼠血清中促炎因子MCP-1的含量升高，肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒后释放的炎性介质组胺含量升高，表明烘烤花生致敏的小鼠体内炎症反应更强。此外，与生花生组小鼠相比，烘烤花生组小鼠血清中IgE、IgG1和IgG2a含量更高，且IgG1/IgG2a＞1，表明烘烤花生具有更高的致敏性，可以引发更强的Th2型过敏反应。综上所述，烘烤花生致敏性增加，引发更强的Th2型过敏反应。

图1 烘烤花生对小鼠血清中细胞因子、组胺和特异性抗体含量的影响

此外，还研究了烘烤是否影响Ara h 3与BMDC的相互作用。FITC标记的Ara h 3-raw的和Ara h 3-roasted的与BMDC孵育，并通过流式细胞术跟踪Ara h 3的摄取。以FITC细胞百分比表示的摄取具有时间依赖性，并在治疗后1 h达到稳定期（图2A）。与FITC标记的Ara h 3-Raw孵育时，Ara h 3-Raw的吸收效率更高，FITC BMDC的百分比达到68.27%，而只有47.53%。在MFI观察中也观察到Ara h 3-的摄取显著增加（图2B）。Ara h 3烘烤处理的BMDC中，Th2型炎症细胞因子IL-10的mRNA水平显著上调，Th2型细胞因子IL-12显著下调（图2C-D），表明烘烤花生中的Ara h 3促进了树突状细胞中Th2型过敏反应的发生。

图2 烘烤对BMDC摄取Ara h3和细胞因子mRNA水平的影响

为了鉴定与Ara h 3-raw和Ara h 3-roasted摄取有关的受体，使用了特定受体的抑制剂。结果表明，这三种抑制剂对Ara h 3-raw摄取的抑制作用较弱且相似。对于Ara h 3，聚肌苷作为SRs抑制剂，显著降低其摄取。尽管FPS-ZM（RAGE抑制剂）和甘露聚糖（MRs抑制剂）在抑制Ara h 3-roasted摄取方面略弱于聚肌苷，但它们都对BMDC摄取Ara h 3-roasted产生了一定的抑制作用（图3）。这些发现表明，烘烤促进了Ara h 3的摄取，并且Ara h 3摄取向受体介导的内吞作用的重新分配可能是由于物理化学性质的变化导致SRs对Ara h 3的更强识别。共焦显微照片与流式细胞术获得的结果一致，在Ara h 3烘烤前，经聚肌苷抑制后，BMDC显示出较弱的荧光信号（图3C）。

图3 加入受体抑制剂后BMDC摄取FITC标记的Ara h 3

花生过敏原的过敏性受到其他结构变化的显著影响（美拉德反应除外）。烘烤会使Ara h 3失去部分二级结构，增加疏水性，展开和聚集，并改变其生物学功能。所有这些Ara h 3的变化增强了对Ara h 3的识别和吸收，并显著刺激BMDC的适应性免疫反应。

此外，结构变化可能会暴露Ara h 3的IgE/IgG结合表位，这也可以作为Ara h 3-roasted过敏性增强的原因之一。IgE/IgG结合能力的增加可能来自Ara h 3的交联。在烘烤过程中，Ara h 3中氨基酸侧链的修饰可能有助于增加先前未暴露的过敏原结合位点，并增强IgE/IgG结合能力。总的来说，烘烤通过改变Ara h 3的物理和化学性质，并通过受体介导的内吞作用促进其吸收，从而增强了Ara h 3的过敏性。

第一作者

王闽佳，女，28岁，上海大学生命科学学院研究生，主要研究方向为烘烤对花生蛋白致敏性的影响及其机理研究，发表学术论文5篇，其中SCI 3篇，EI 1篇,中文核心1篇。

通信作者

陈沁，女，教授，博士生导师，上海市植物生理学会副理事长。主要从事动物疫病和微生物污染的预警以及过敏和糖尿病的机理研究。通过神经网络、元胞自动机、传播动力学模型，建立了动物疫病、重金属及微生物污染的预警机制。先后主持“十二五科技支撑”和“十三五国家重点研发项目”子课题以及“上海市科技兴农项目”，参与中央引领地方专项及长三角区域进口食品、农产品及化妆品智慧监管等项目。参与获2014年上海市科学技术奖二等奖；2020年上海市科学技术奖三等奖（排名第2）。近五年已在Food Control、Food Chemistry（top期刊）和Transboundary and Emerging Diseases等学术期刊上发表学术论文61篇，总引用次数超过500次。

Study on mechanism of increased allergenicity induced by Ara h 3 from roasted peanut using bone marrow-derived dendritic cells

MinJia Wanga,1, Shuo Wanga,1, Xiaodong Sunb, Zhirui Denga,*, Bing Niua, Qin Chena,*

a School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China

b Medical School, Shanghai University, Shanghai 200444, China

1 Authors contributed equally to this article.

*Corresponding authors.

Abstract

Little information was so far available about allergenic mechanism of the roasted peanut allergens during initial stages of allergy. The purpose of this study was to determine the influence of roasting (150 °C, 20 min) on biochemical and biological properties of Ara h 3, a major peanut allergen. Allergenicity of roasted peanut emulsion to mice, differences in uptakes between Ara h 3 purified from raw peanuts (named as Ara h 3-Raw) and that purified from roasted peanuts (named as Ara h 3-Roasted) by bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) and the implication of cell surface receptors involving in uptake, and changes in glycosylation and structure of Ara h 3 after roasting were analyzed in this study. This study suggested that roasting increased allergenicity of peanut to BALB/c mice. Maillard reaction and structural changes of Ara h 3 induced by roasting significantly altered the uptake of Ara h 3-Roasted by BMDCs, and modified Ara h 3 fate in processes involved in immunogenicity and hyper allergenicity, indicating that food processing pattern can change food allergenicity.

Reference:

WANG M J, WANG S, SUN X D, et al. Study on mechanism of increased allergenicity induced by Ara h 3 from roasted peanut using bone marrow-derived dendritic cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 755-764. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.009.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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