FSHW | 花生过敏原Ara h 3特异性纳米抗体及检测方法

Introduction

花生因其丰富的膳食成分和营养价值，被推荐每日摄入。然而，花生源性变应原诱发的过敏性疾病，尤其是终生的过敏反应，已经引起了人们对过敏原检测的极大关注，以避免意外摄入花生变应原，以及摄入后的治疗方法。到目前为止，国际免疫学会联合会（IUIS）过敏原命名委员会已经确定了17种花生过敏原（Ara h 1～17），其中，Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3被认为是最重要的花生过敏原。研究表明，40%的花生过敏原敏感人群的血清IgE可识别Ara h 3。

目前，还没有有效的治疗策略用于花生过敏原引起的过敏反应，过敏原的检测和避免意外摄入仍然是预防过敏反应的首要策略。因此，花生过敏原检测方法的建立已成为食品基质中过敏原监测的重要内容。传统特异性抗体的制备依赖于纯化的过敏原，用纯化的过敏原进行免疫有望提高足够的免疫反应，以促进阳性克隆的选择。在免疫过程中，使用花生提取物进行免疫将更具成本效益，然而，获得特异性抗体的可能性尚不清楚，需要确定。本研究拟采用一种替代性抗体纳米抗体Nanobodies（Nbs）来验证研究假设，并建立一种针对花生过敏原的免疫分析方法。纳米抗体来源于驼源重链抗体（HCAb），其天然缺失轻链和CH1结构域。克隆HCAb的抗原结合序列的可以获得工程抗体片段，因为其大小在纳米范围（2.4×4 nm），称为纳米抗体。由于其体积小、抗原结合能力强，被广泛的应用于基础研究、疾病诊断和治疗领域。

因此，本研究拟通过无偏策略，基于花生总蛋白来筛选针对花生过敏原的特异性纳米抗体。本研究制备了针对花生过敏原蛋白的纳米抗体，并验证了纳米抗体的靶向抗原为花生过敏原Ara h 3，为纳米抗体在无偏过敏原分析中的成功应用提供了结果。基于制备的纳米抗体，初步建立了一种用于检测Ara h 3的夹心ELISA免疫分析方法，具有较高的灵敏度和特异性。此外，所制备纳米抗体能够与荧光或基于生物传感器的免疫分析等先进检测技术相结合，可以进一步提高Ara h 3过敏原的检测灵敏度和适用性。

Results and Discussion

纳米抗体筛选与制备

基于无偏免疫策略，运用花生总提取蛋白免疫羊驼，并提取外周血淋巴细胞以构建纳米抗体免疫文库，成功构建了一个多样性为1.44×10 7 CFU/mL，正确插入率为75%的免疫文库，基于噬菌体展示技术进行了多轮富集筛选，富集率从1.2到7.3，经过PE-ELISA成功筛选了34个阳性克隆，经过序列分析和鉴定将其归为6个不同的纳米抗体，对纳米抗体的生物活性和结合特性进行了评价。

图1 花生总提取蛋白纳米抗体的富集筛选与鉴定

靶向抗原鉴定

基于免疫共沉淀对Nb P43的靶向抗原进行免疫捕获，结果显示多条带分布，通过LC-MS/MS进行靶向抗原鉴定，结果显示为花生过敏原Ara h 3（UniProtKB:E5G077）和Gly 1（UniProtKB:Q9FZ11）。详细分析表明Gly-1属于Ara h 3家族，Gly 1和Ara h 3的比对显示了高度的序列一致性（72%），这为Nb P43的交叉反应性提供了合理的解释，将Nb-P43靶向Ara-h3和Gly-1可开发一种有效监测食品基质中花生污染的免疫分析方法。

图2 纳米抗体靶向抗原的鉴定

免疫分析方法构建

基于制备的纳米抗体Nb P43构建了花生过敏原Ara h 3双抗夹心ELISA检测方法，首先对检测抗体及捕获抗体的浓度进行了优化，选定5及7.5 μg/mL分别为捕获抗体和检测抗体工作浓度，之后基于花生总提取蛋白构建了方法的标准曲线：y＝1.16ln(x)+0.88（R 2 ＝0.9922），基于总蛋白分析了所构建方法的检测限为53.13 ng/mL，如能制备Ara h 3单一内标蛋白可确定本方法的实际检测限和检测范围，基于实际样品分析的回收率为93.8%至114.75%。

图3 基于纳米抗体的花生过敏原Ara h 3免疫分析方法

Conclusion

本研究报道了花生过敏原蛋白特异性纳米抗体的制备及靶向过敏原的成功鉴定，为非富集免疫原和抗原的选择性应用提供了证据。基于所制备的花生过敏原特异性纳米抗体构建了夹心ELISA检测方法并进行了验证，可用于监测食品基质中花生蛋白的污染。所建立的免疫分析具有很高的亲和力和灵敏度，在实际食品样品检测中具有潜在的适用性。此外，所制备的纳米抗体能够与更先进的检测技术相结合，有助于建立更实用、更高灵敏度的免疫分析方法。

一

胡耀中，男，工学博士，现为南开大学医学院讲师，主要研究方向为基于纳米抗体的食物安全检测和评价；基于纳米抗体的疾病诊断与治疗技术开发；膳食营养组分与机体免疫互作，特别是先天性免疫调控。目前主持国家自然基金1项，在国内外期刊公开发表学术论文30余篇，其中SCI收录30余篇。

王硕，男，南开大学医学院特聘教授，教育部长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者，首批入选国家“万人计划”领军人才，人事部“百千万人才工程”国家级人选，教育部“新世纪优秀人才”计划，科技部“创新人才推进计划”中青年科技创新领军人才，享受国务院特殊津贴，主要研究领域包括小分子免疫检测理论和检测新技术的研究与开发；“仿生抗体”合成与反应机理及替代生物抗体免疫检测理论和检测技术；食品加工过程质量安全控制技术的研究和开发；食品安全风险评估；食品营养与免疫研究。主持多项国家自然科学基金及重点研发计划项目，以第一或通讯作者身份发表学术论文400余篇。

Selection of specific nanobodies against peanut allergen through unbiased immunization strategy and the developed immuno-assay

Yaozhong Hua,1, Chuan Zhangb,1, Jing Lina, Yi Wanga, Sihao Wua, Ying Sunb, Bowei Zhanga, Huan Lva, Xuemeng Jia, Yang Lub, Shuo Wanga,*

a Tianjin Key Laboratory of Food Science and Health, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China

b College of Food Science and Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

1 These authors contribute equally.

*Corresponding author.

Abstract

Peanut allergy is considered to be a major health issue with global effects. To date, no effective curative approach has been applied for the therapy of the anaphylaxis resulting from the peanut allergens. The accurate and effective detection methods for the surveillance of allergens in food are still the primary strategies to avoid allergic diseases. In this study, nanobodies (Nbs) derived from the Heavy-Chain only Antibodies (HCAbs) were selected against the general peanut protein extract through the unbiased strategy to facilitate the development of the sandwich ELISA for the detection and surveillance of peanut allergen contamination. The target antigen of the selected Nb was identified as peanut allergen Ara h 3, and a cross-reaction was observed with the member of Gly 1 from the Ara h 3 family. The applicability of the self-paired Nb P43 on the establishment of the immuno-assay was verified. A sandwich ELISA against peanut allergen was developed, which reached a linear range of 0.2－10.6 μg/mL, and a limit of detection of 53.13 ng/mL.

Reference:

HU Y Z, ZHANG C, LIN J, et al. Selection of specific nanobodies against peanut allergen through unbiased immunization strategy and the developed immuno-assay[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 745-754. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.008.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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