mBio | 凋亡还是抗凋亡？囊泡病毒离体感染后对宿主细胞调控性死亡的干预与利用

近日，湖南农业大学植物保护学院蔬菜害虫生物防治与综合防控研究黄国华团队在mBio上发表了题为“Apoptosis or Antiapoptosis? Interrupted Regulated Cell Death of Host Cells by Ascovirus Infection In Vitro”的文章，阐述了在离体感染过程中囊泡病毒对宿主细胞调控性死亡（regulated cell death，RCD）的干预与利用。

图1：文章标题

病毒感染后会引起宿主细胞的一系列防御反应，其中被研究最多的便是宿主细胞的凋亡与病毒的抗凋亡之间的博弈。囊泡病毒(ascovirus)是一类大型环状DNA病毒，主要感染鳞翅目幼虫，其细胞水平的致病过程一直被认为是一种类似细胞凋亡的过程——囊泡病毒利用宿主细胞凋亡过程中产生的凋亡小体包裹形成自身成熟的囊泡。这种特殊的致病历程获得了不少囊泡病毒学家的认同，但团队前期的研究发现囊泡病毒在宿主幼虫体内的活体感染过程中并未呈现典型的凋亡特征【1】。由于离体实验相较活体实验有更高的重复性以及更便捷的操作性，因此，研究者以我国分离的本土囊泡病毒毒株——烟芽夜蛾囊泡病毒3h株（Heliothis virescens ascovirus 3h, HvAV-3h）为囊泡病毒的代表，将其接种至离体培养的甜菜夜蛾脂肪体细胞（IOZCAS-SpexII-A, SeFB）中，以流式细胞术对感染囊泡病毒后的宿主细胞进行检测，结果如图2所示。在感染的前期（3-12 hpi），细胞膜的通透性明显增强，从感染后24 h开始，高通透性细胞的含量明显降低。这一结果与活体观察到的相一致，在感染的前期宿主细胞处于类似于焦亡/坏死的状态，因此细胞膜具有较高的通透性。

图2：感染囊泡病毒宿主细胞凋亡、坏死检测

研究者利用了凋亡的一种诱导剂双氧水（H2O2），向感染HvAV-3h后的SeFB细胞、棉铃虫胚胎细胞（Ha-E）以及草地贪夜蛾卵巢细胞（Sf9）中加入不同剂量的H2O2，并以H2O2处理的健康细胞为对照，对细胞形态以及细胞生长抑制率进行了比较（如图3所示）。H2O2处理后，HvAV-3h感染的细胞生长抑制率明显低于健康细胞的生长抑制率，表明囊泡病毒的感染使得宿主细胞具备了一定的抗凋亡能力。

图3：H2O2对HvAV-3h感染细胞的影响

进一步以H2O2、放线菌素D（ActD）、cMYC抑制剂（cMYC）和TNF-α + SM-164凋亡诱导剂（T/S）对感染后不同时期的宿主细胞进行诱导，并检测诱导后不同时间点病毒基因组的拷贝数（如图4所示）。与DMSO处理的细胞相比，几种凋亡诱导剂处理的感染前期SeFB及Ha-E细胞（0-6 hpi）病毒基因组DNA的复制被抑制；从感染后24 h开始，cMYC以及T/S处理后在处理的后期病毒的基因组DNA拷贝数会增多。

图4 ：诱导凋亡对病毒DNA复制 的影响

分别制备甜菜夜蛾的4个caspase蛋白多克隆抗体（SeCasp-1、SeCasp-6、SeCasp-7、SeCasp-8）以及一个甜菜夜蛾的IAP蛋白多克隆抗体（SeIAP），分别检测不同诱导剂处理后HvAV-3h感染的宿主细胞中RCD相关蛋白的表达情况（如图5所示）。T/S处理下HvAV-3h感染的SeFB细胞，SeCasp-6会有明显的切割，且囊泡病毒的主要衣壳蛋白（MCP）表达量显著升高。这一点预示着病毒的复制和包装与SeCasp-6的切割有一定的关联。

图5：凋亡诱导剂促进SeCasp切割和病毒主要衣壳表达

进一步的免疫共沉淀研究结果表明（如图6所示），SeCasp-6与SeCasp-7之间没有互作，但二者均与SeIAP有明显的互作；但这种互作在HvAV-3h感染后被解除。

图6：SeCasp-6/SeCasp-7/SeIAP免疫共沉淀

综合以上结果，我们明确了在囊泡病毒感染的早期，宿主细胞处于焦亡状态（细胞膜通透性强，且GSDMD有明显的切割条带），这个时期诱导凋亡会导致病毒的DNA复制受到严重抑制；在囊泡病毒感染的后期，宿主细胞的凋亡被抑制（主要通过抑制SeCasp-6的活性），而此时诱导凋亡会在一段时间后使病毒DNA的拷贝数明显增加。宿主的SeCasp-6、SeCasp-7、SeIAP在整个宿主细胞RCD转换的过程中有着重要作用，但具体的作用模式还未完全阐明。本研究的结果较详细揭示了囊泡病毒在感染的不同时期对宿主细胞RCD的干预策略，以及宿主RCD与囊泡病毒自身复制和蛋白表达之间的关系，为后续了解病毒与宿主互作提供了新视野。

参考文献：

1. Yu H, Xiao H-Y, Li N, Yang C-J, Huang G-H. 2022. An ascovirus utilizes different types of host larval regulated cell death mechanisms to produce and release vesicles. J Virol. https://doi.org/10.1128/jvi.01566-22.(online)

本期编辑：可乐小鱼儿