PNAS | 中国农业大学张永亮研究组发现新的植物免疫调控模块

近日，中国农业大学生物学院张永亮教授与加州大学戴维斯分校Savithramma P. Dinesh-Kumar教授合作在PNAS在线发表了题The MAPK-Alfin-like 7 module negatively regulates ROS scavenging genes to promote NLR-mediated immunity的研究论文。该研究鉴定到一个参与NLR蛋白介导的植物天然免疫的新的调控模块MAPK-Alfin-like 7，并揭示了其通过抑制ROS清除相关基因的表达来增强N基因介导的植物免疫。

自然条件下植物经常受到真菌、细菌、害虫和病毒等多种病原物的威胁。在病原与宿主长期的军备竞赛中，植物进化出了两层先天免疫系统来保护自己免受病原物的攻击：病原相关分子模式触发的免疫（Pathogen-associated molecular patterns-triggered immunity, PTI） 和效应因子触发的免疫（Effector-triggered immunity, ETI） 。这两个免疫信号分支相互依赖，协同赋予植物对病原物的抗性。尽管PTI和ETI的起源存在差异，但它们拥有共同的下游信号转导通路，如丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 级联反应的激活、钙离子内流、ROS积累和广泛的转录重编程等，所有这些下游事件共同构成了复杂的免疫信号调控网络。

转录重编程是植物免疫激活过程中常见的事件之一，该过程涉及诸多转录因子。尽管此前已有一些转录因子被报道参与胞内核苷酸结合的富含亮氨酸重复蛋白 （NLR） 介导的免疫反应，但是它们大多数都是转录激活因子，而关于转录抑制因子如何调控NLR介导的植物免疫鲜有报道。为了深入研究NLR蛋白介导的免疫调控网络，该团队前期以抗烟草花叶病毒 （TMV） N蛋白为研究模式，利于基于TurboID的邻近标记技术鉴定到多个与N蛋白潜在互作的宿主因子 (Zhang et al. 2019, Nature Communications) 。其中，一个名为Alfin-like 7 （NbAL7） 蛋白富集程度较好，排名较高。NbAL7属于Alfin-like家族蛋白。前人研究结果表明，该家族蛋白在植物应对非生物胁迫如盐和干旱胁迫中发挥重要作用，但是关于Alfin-like家族蛋白尤其是AL7是否在植物应对生物胁迫中发挥功能尚无报道。

该研究证实NbAL7与抗性蛋白N在体内和体外发生互作。为了研究NbAL7在植物天然免疫中的功能，在转N基因本生烟的背景下分别培育了NbAL7的过表达、敲低和敲除转基因植株。敲除和敲低NbAL7显著削弱了N基因介导的对TMV的抗性，而过表达NbAL7则表现出抗性增强。由此说明，NbAL7作为一个正调控因子参与N基因介导的免疫反应 。进一步研究表明NbAL7是一个定位于细胞核的转录抑制因子，ChIP-seq结合ChIP-qPCR、EMSA和双荧光素酶报告系统等常规DNA-蛋白互作验证手段分析表明，NbAL7可以结合到ROS清除基因如APX2、GR和GPX2的启动子区域的G-box基序并抑制它们的转录。在过表达NbAL7的情况下，ROS积累明显增强，并伴随坏死反应。而当敲除或敲低NbAL7时，TMV侵染后引起的ROS积累水平明显减弱。

此项工作的另一重要发现是，NbAL7可作为MAPK激酶SIPK和WIPK的底物，其活性受到磷酸化修饰的调控。SIPK和WIPK在体内和体外均与NbAL7互作并磷酸化其Ser174位点。NbAL7的Ser174位点的磷酸化削弱了其与N蛋白的互作，但显著增强了其与靶基因DNA的结合能力并进而抑制ROS清除基因的转录，最终促进了ROS的积累并激活N蛋白介导的抗病毒免疫。此外，NbAL7不仅参与N蛋白介导的植物免疫，还参与其它TIR-NBS-LRR型R蛋白如Roq1和RRS1-R/RPS4介导的细胞坏死反应 。

AL7在N基因介导抗TMV免疫反应中的作用模型

综上所述，该研究揭示了一新的MAPK-AL7转录调控模块通过抑制ROS清除基因的表达来促进ROS积累，从而正调控植物天然免疫的新机制，明确了Alfin-like家族蛋白在植物应对生物胁迫中的新功能，拓宽了人们对NLR蛋白介导的植物免疫信号转导网络的认识。

中国农业大学生物学院张永亮教授为本论文的通讯作者, 美国加州大学戴维斯分校的Savithramma P. Dinesh-Kumar教授为该论文共同通讯作者，工作主要在中国农业大学完成。博士研究生张定谅为第一作者。中国农业大学李大伟教授和郭海龙教授参与了该项工作，研究工作还得到了华中农大李博教授和中国农大王献兵教授、于嘉林教授、韩成贵教授、马男教授、任东涛教授和李溱教授在内的多位老师在实验材料和技术方面的帮助和建议，该研究由国家自然科学基金资助完成。

论文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2214750120