异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变的耐药新机制

异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是三羧酸循环中催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸（α-KG）的关键代谢酶，也是急性髓细胞白血病（acute myeloidleukemia，AML）中突变最为频繁的肿瘤代谢基因（~20%）。异柠檬酸脱氢酶突变会催化α-酮戊二酸产生立体异构的致癌代谢物 R-2-羟基戊二酸（R-2HG），同时消耗NADPH产生NADP+。目前，IDH1突变抑制剂AG-120 （Ivosidenib）和IDH2突变抑制剂AG-221（Enasidenib）已成为靶向治疗复发性和难治性AML患者中IDH突变的临床一线药物。这类 IDH 突变的变构抑制剂能够有效抑制 IDH突变的活性和致癌代谢物R-2HG 的产生，进而逆转白血病细胞的分化障碍。然而，近年来不断有报道称接受IDH突变抑制剂治疗的AML患者会产生突变导致治疗耐药性。 现有研究表明部分突变存在于IDH异二聚体界面影响抑制剂的结合【1】或在IDH1和IDH2亚型之间切换【2】以恢复IDH突变的活性从而产生R-2HG， 而大部分的突变导致抑制剂治疗耐药的原因仍有待进一步研究。因此，探究其耐药性产生的原因及研发新型治疗方案成为目前亟待解决的迫切问题。

2023年1月1日，美国西南医学中心徐剑（Jian Xu）课题组吕军华等研究人员在Cancer Discovery正式刊发题为Disabling Uncompetitive Inhibition of Oncogenic IDH Mutations Drives Acquired Resistance的研究论文【3】。该研究通过CRISPR base editing构建了一系列具有内源性的IDH1 和 IDH2 致癌热点突变的白血病细胞系，通过不同的筛选策略首次发现了驱动AML患者对IDH抑制剂耐药的新型突变位点，阐明了该突变位点产生耐药性的作用机制，为解决IDH突变的AML患者的耐药性问题提供了理论依据和新方向。

近年来越来越多的AML患者在接受 IDH 突变抑制剂治疗后呈现对抑制剂的耐药性，由于缺乏临床相关的IDH突变细胞或动物模型对IDH突变抑制剂的耐药机制进行系统的筛选和分析，导致目前仍未完全解析R-2HG 恢复引起的耐药机制。为解决该耐药性问题，作者首先通过CRISPR base editing在TF-1，K562和MOLM-13中构建了一系列内源性的单等位基因 IDH1 和 IDH2 致癌热点突变（IDH1R132H，IDH2R140Q，IDH2R14OW和IDH2R172K）的细胞系（如下图）。

随后作者利用构建的IDH突变细胞系进行两种不同的筛选来确定与 IDH 抑制剂耐药性相关的突变。 一种筛选方式为模拟IDH突变的AML病人临床治疗过程，分别以相应的抑制剂对IDH突变细胞系处理16周并进行IDH基因靶向测序以检测所富集的突变。另一种筛选方式为构建IDH2饱和突变库对IDH2的氨基酸进行饱和筛选与抑制剂耐药性相关的突变。IDH2饱和突变库共有7,742条突变体将IDH2的41位至452位的每个氨基酸（除线粒体定位信号和终止密码子）突变为其它19种氨基酸。在抑制剂处理10周后进行IDH2基因靶向测序并分析突变位点的富集。通过以上两种高效的筛选并结合交叉比对，作者发现IDH异二聚体界面的突变（IDH2Q316E和IDH2I319M）显著富集。通过对所富集突变位点的结构分析，作者发现了一系列影响 IDH 异二聚体与 NADPH 结合的新型突变。此外，细胞体外实验和小鼠体内实验进一步证实了与IDH二聚体界面的突变（IDH2Q316E和IDH2I319M）一样，IDH 异二聚体与 NADPH 结合相关的突变也同样会导致细胞和小鼠对抑制剂的耐药性。更重要的是，对耐药性的AML病人样品的IDH基因靶向测序进一步验证了IDH 异二聚体与 NADPH 结合相关的突变（IDH1T313I，IDH2E343V，IDH2A347T和IDH2V351I）以顺式或反式突变的方式在临床应用IDH突变抑制剂治疗的过程中逐步累积。

据统计约有二分之一的癌症靶向药物为小分子抑制剂，通常涉及竞争性，非竞争性或反竞争性抑制作用。竞争性抑制剂在结构上类似于正常底物，从而与底物竞争酶分子上的结合位点。非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的部分结合，使酶分子的构象变化从而影响酶与底物的结合。相比之下，反竞争性抑制剂仅与酶-底物复合物结合，从而形成稳定的酶-底物-抑制剂复合体以影响酶促反应（如下图）。

作者利用纯化的IDH野生型和突变型异二聚体证明IDH突变抑制剂是NADPH依赖的反竞争性抑制剂。 一系列实验也证实NADPH 结合位点的突变以顺式方式阻止形成稳定的IDH 异二聚体和NADPH复合物，进而影响抑制剂的结合和驱动耐药性的产生（如下图，model3）。与NADPH 结合相关的突变以顺式或反式突变都可在耐药性的AML病人样品中检测到的结果相一致，IDH突变抑制剂也被证明是NADP+依赖的反竞争性抑制剂。NADP+ 结合位点的突变以反式方式阻止形成稳定的IDH 异二聚体和NADP+复合物，从而导致耐药性的产生（如下图，model4）。

综上所述，在该研究工作中，研究人员构建了一系列内源性的单等位基因 IDH1 和 IDH2 突变的白血病细胞系，这将为研究IDH突变的功能及作用机制提供高效的工具。通过药物筛选和氨基酸饱和突变筛选结合结构分析发现了位于 IDH 异二聚体内 NADPH 结合位点的新型突变可导致抑制剂治疗的耐药性。作者进一步证明破坏NADPH依赖的反竞争抑制作用在影响抑制剂的有效性的同时促进了耐药性的产生。该研究阐明了IDH抑制剂耐药性产生的分子机制，将有助于改进 IDH 突变癌症的治疗策略，并为解决临床患者的耐药性问题提供了理论依据和全新思路。

https://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article/doi/10.1158/2159-8290.CD-21-1661/711785/Disabling-Uncompetitive-Inhibition-of-Oncogenic

附注：徐剑 (Jian Xu)教授毕业于复旦大学，UCLA博士，博士后师从Dr. Stuart Orkin进行造血干细胞的表观遗传调控和血红蛋白基因的调控机制的研究。研究成果以第一或共同第一作者发表在Nature和Science等期刊上。其中关于血红蛋白基因调控机制的研究专利已经应用到针对镰刀性贫血和地中海贫血基因治疗的临床试验中。2014年加入西南医学中心（UT Southwestern），主要从事肿瘤基因组学，基因表达调控，表观遗传学和肿瘤代谢的研究，近几年在Cell,Cancer Discovery，Nature Cell Biology,Nature Genetics和Nature Metabolism等杂志上发表多篇高水平研究论文。

徐剑团队诚邀优秀博士后加盟，欢迎联系（https://cri.utsw.edu/scientists/jian-xu-lab/）

制版人：十一

参考文献

1. Intlekofer, A.M., et al., Acquired resistance to IDH inhibition through trans or cis dimer-interface mutations.Nature, 2018. 559(7712): p. 125-129.

2. Harding, J.J., et al., Isoform Switching as a Mechanism of Acquired Resistance to Mutant Isocitrate Dehydrogenase Inhibition.Cancer Discov, 2018. 8(12): p. 1540-1547.

3. Lyu, J., et al., Disabling Uncompetitive Inhibition of Oncogenic IDH Mutations Drives Acquired Resistance.Cancer Discov, 2022.