新冠核酸提取试剂与扩增试剂不匹配？检验人该如何应对？

来源：检验医学网

作者：侯赋园、吴敏华、蔡镓芊

单位：广州市天河区妇幼保健院

一、异常发现

在新引进B厂家扩增试剂试用过程中，发现扩增结果异常（提取试剂厂家为A）。共48个样本，内参失败22个，成功26个。结果如图1和2所示。

图1 B试剂初扩全数标本内参显示（48个）

图2 B试剂初扩内参正常结果显示（26个）

二、原因猜测

（1）人员操作不当

（2）提取效果不佳

（3）提取试剂与扩增试剂匹配性不佳（主要考虑）

（4）扩增仪问题

（5）扩增试剂质量问题

三、验证试验

（1）使用原核酸、同批次B扩增试剂、其他同型号扩增仪重扩

内参失败21个，成功27个。如图3和4所示。失败孔与初扩失败孔几乎重叠。说明人员操作不当或者扩增仪有问题可能性较小，B试剂质量应该也不是问题。

图3 B试剂重扩全数标本内参显示（48个）

图4 B试剂重扩内参正常结果显示（27个）

（2）使用原核酸、A厂家扩增试剂重扩

48个内参均起跳成功，只有3个样本内参相对离群，该离群样本在B试剂初扩及重扩中内参均失败。如图5和6所示。说明A提取试剂与A扩增试剂匹配结果良好。

图5 原核酸、A试剂重扩（48个）

图6 原核酸、A试剂重扩内参正常结果（45个）

综上，可推测B扩增试剂结果异常的原因极可能为B扩增试剂与A提取试剂匹配性不佳。此外，结合近几天实验结果，A提取试剂效果比往常稍差。但是解决掉该“稍差”的问题后，B扩增试剂的不匹配仍然存在。从上述试验结果可知，该原因应该不是引起B扩增内参失败的主要原因。

四、B扩增试剂与A提取试剂匹配性不佳原因探索

（1）模板稀释试验

B厂家扩增试剂说明书点样量为20ul。试验将点样量改为10ul洗脱液+10ul去离子水，B厂家试剂扩增，检测了32个样本。结果内参均起跳成功，全部通过。如图7所示。

图7 原核酸、B试剂稀释一倍点样重扩

（2）加大模板量，考察A提取与A扩增试剂匹配性

A扩增试剂说明书点样量为5ul，上述32个样本原核酸，点样量为20ul。32个内参均成功起跳，CT值与日常相符，全部S型曲线。如图8所示。

图8 原核酸、A试剂加倍模板量重扩

五、小结

以上试验结果表明：A提取试剂提取的核酸模板中存在干扰物质，干扰了B扩增试剂的扩增结果。A提取试剂与A扩增试剂匹配性更好。

六、寻找解决办法

对于B扩增试剂来讲，有干扰性物质，说明A提取得到的核酸模板纯度可能不够。因此首先把解决问题的突破口指向提取环节。同时提取环节也是比较容易解决的一环。

以上实验的核酸模板均由A厂家T96型提取仪96程序提取，B扩增效果差。后续实验改为A厂家I48提取仪18程序提取。B厂家扩增试剂效果显著提高，但是每板仍有3个左右内参不合格。

对比了两个型号的提取过程，发现T96型96程序提取中，只使用了洗涤剂1。而I48提取仪18程序提取中只使用了洗涤剂2。其他提取程序参数稍有不同。在以往核酸提取中，一般有两步洗涤，分别为洗涤剂1和2，其作用分别为洗去生物大分子和盐离子，达到纯化作用。因此考虑，上述结果差异可能是由于仅使用了单种洗涤剂所引起，但也不排除其他提取参数也有影响。经过尝试，添加蛋白酶K参与提取，洗涤剂1和2对换，结果都没有足够改善。说明其他参数作用也不可忽视，包括提取仪型号。

七、尝试新提取程序

考虑到纯化是关键因素，经过两步洗涤，核酸模板纯度将更佳。因此将I48提取仪18提取程序更改为27程序。使用B试剂扩增，32个样本内参全部起跳，相对聚集，内参全部通过。如图9所示。

图9：A厂家I48-27提取、B试剂重扩

八、讨论

A厂家I48-27提取程序同时具有洗涤1和洗涤2的步骤，而且与其他两个提取程序相比，裂解时间延长近一倍，其他参数差异不明显，I48-18与I48-27使用相同的提取试剂。在后期的使用中，同样显示I48-27与B扩增试剂匹配实验效果良好。以上说明，A厂家I48-27提取的模板与B扩增试剂匹配性改善的主要因素应当是同时使用洗涤1和2和裂解时间延长。

根据以往使用经验，A厂家提取试剂（裂解步骤采用化学法）对黏液的抵抗能力较C厂家（裂解步骤采用蛋白酶K法）弱。而且相对A化学法提取，C厂家该法提取与更多的厂家扩增试剂匹配性更好。黏液可以造成提取质量不高。对抗黏液可以使用蛋白酶K消化，也可以采样反复冻融，达到软化、降低其粘性减少对取样、提取、扩增的干扰。推测：即使使用化学法，延长裂解时间应当也能降低黏液的不利影响，提高提取质量。这与上述I48-27提取效果有相符之处。

九、总结

检测系统有主要要素改变时，应当及时考察提取仪-提取程序-扩增试剂-扩增仪，甚至是整个检测系统各个组合方式的性能效果。例如提取试剂与扩增试剂属于非推荐配套产品时，以及检验系统中某个试剂升级优化后。目前多个厂家新冠扩增试剂均开始升级提高灵敏度，更改了旧版试剂的工艺或引物或探针或酶有做调整，实验室引进时需要加以留意。

扩增试剂说明书均有表述其推荐的配套提取仪及提取试剂，该配套是经过厂家开发、验证、注册检验，然后药监局审批的，效果是有保障的。因此实验室应尽可能使用配套推荐产品，否则应该视为自建系统（LDT）进行性能确认试验。

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