Nature子刊：李颖团队开发基于Cas12a的多靶标核酸检测技术平台MiCaR

快速、低廉和多重病原体的检测对人类健康和全球安全具有重大价值，在当前新冠大流行背景下，其意义尤为显著。目前，二代测序（NGS）和荧光定量PCR （RT-qPCR） 已被广泛用于多种病原微生物的检测。近年来，基于CRISPR的核酸检测方法，因其较高的特异性和灵敏度，也已被应用于感染类诊断方法的开发。CRISPR诊断方法crRNA准确识别核酸靶标序列，并激活CRISPR蛋白剪切报告分子，从而释放出信号实现靶标的检测。然而，由于缺乏合适技术的引入和集成，现有大多数CRISPR诊断平台仍只能检测少数核酸靶标分子。

近日，中国科学院精密测量院李颖团队等在Nature Communications期刊发表了题为： Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification 的研究论文。

研究团队利用微流控芯片“空间编码”技术，并结合CRISPR和恒温扩增RPA技术，开发了一种多靶标核酸检测技术平台——MiCaR（Microfluidic device integrated with CRISPR-Cas12a and multiplex RPA） 。该方法在40分钟内可检测多达30种不同的病原体，灵敏度可达0.26 aM。

“MiCaR”平台检测原理

“MiCaR”多靶标核酸检测技术基于微流控空间编码和CRISPR-Dx技术，可在40分钟内检测30种不同的病原体，灵敏度达到了0.26 aM。

“MiCaR”检测平台特点可总结为：

1、有效且正确扩增多个（如≥4个）核酸靶点

2、在合适的温度下扩增和识别靶标

3、精确识别靶标，不受任何干扰

4、准确区分信号并将其与对应靶标进行关联

研究人员通过有效地检测9价HPV疫苗对应的9种HPV亚型，证明了MiCaR的实用性，以及其在感染性疾病诊断和流行病学监测方面的潜力和应用价值。

“MiCaR”平台HPV检测流程

以HPV亚型检测为例，演示“MiCaR”平台的使用流程。首先进行取样，加热样本释放核酸，将释放的核酸直接进行重组酶聚合酶扩增 （RPA） ，最后将扩增产物和CRISPR检测液加入到放射状芯片（SS-Chip）中，加热后读取结果。

其中SS-Chip由30个孔位轮状辐射分布并与中央孔位相连，CRISPR检测液提前加入30个孔位，样本从中央孔位加载，每个孔位都能独立进行CRISPR检测。

“MiCaR”平台对九种HPV亚型检测

为验证“MiCaR”平台对九价疫苗里9种HPV病毒亚型检测能力，该研究将含有9种HPV亚型各自特定片段的质粒和9种crRNA进行交叉反应，结果显示其检测特异性高（如下图所示）；制备9种不同浓度的HPV亚型靶标质粒 （10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、0 M） 验证其灵敏度， 结果显示对所有靶标检测限达10-17至10-18M。

9种HPV质粒和9种crRNA交叉实验

进一步对100例HPV临床样本分型检测，结果显示“MiCaR”检测性能良好，阳性和阴性预测一致性分别为97.8%和98.1%，灵敏度和特异性分别为97.8%和98.1%。

HPV临床检测（红色）和MiCaR检测（绿色）结果比对

对八种呼吸道病毒检测板（RVP）进行检测

研究基于“MiCaR”的方法检测8种最具临床相关性的呼吸道病毒，包括B型流感病毒 （FLUBV） 、人冠状病毒NL63 （HCoV-NL63） 、人冠状病毒OC43 （HCoV-OC43） 、人呼吸道合胞病毒 （HRSV） 、人冠状病毒HKU1 （HCoV-HKU1） 、SARS-CoV-2、人副流感病毒3型 （HPIV-3） 和人偏肺病毒 （HMPV） ，通过对8种RVP靶标质粒与8种crRNA进行交叉反应实验，和对8种RVP靶标混合质粒与8种crRNA分别进行CRISPR检测，结果均表明“MiCaR”对RVP靶标检测强特异性，进一步证明“MiCaR”方法可以作为一种多病原体核酸检测的通用平台。

研究团队表示， “MiCaR”充分展现了多重RPA的扩增、CRISPR/Cas12a系统在靶标识别方面的高特异性，以及微流控设备在液体处理方面的显著作用 。该研究虽然只通过9种HPV亚型和8种呼吸道病毒验证“MiCaR”检测平台的通用性，但其 （30 plex SS-Chip） 单次检测靶标数量可达30个。团队将继续优化MiCaR扩增和检测条件及微流控装置，以实现一管法和自动化操作。

中科院精密测量院徐志辰博士和湖北省妇幼陈冬娟博士为论文共同第一作者，精密测量院核酸复合物结构与功能研究组李颖研究员为通讯作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-34086-y

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