上海
mRNA药物和疫苗是当前生物医学热点方向，而mRNA体外合成的唯一方法是基于单亚基RNA聚合酶的体外转录（IVT）。鉴于自然界单亚基RNA聚合酶的稀少和研究难度，体外转录技术工具酶为40多年前发现的噬菌体T7 RNA聚合酶所垄断，这是由于其高产率和转录本的高保真度，很适合体外RNA的生产，因此在科研和商业化开发中得到了普遍应用。然而，T7 RNA聚合酶本身的性能缺陷，正在成为制约RNA领域发展的瓶颈。
对mRNA药物来说最严重的问题是，T7 RNA聚合酶在体外转录中产生的双链RNA（dsRNA）副产物，因为双链RNA模拟病毒基因组激活细胞免疫反应，即使微量也会引发强烈的细胞毒性，从而影响药效和安全性。相比DNA体外合成技术中有众多性能各异的DNA聚合酶工具可供选择，RNA体外合成亟需更多新型工具酶的发现和开发。
近日，华中科技大学生命学院朱斌教授团队在RNA Biology期刊发表题为：Psychrophilic phage VSW-3 RNA polymerase reduces both terminal and full-length dsRNA byproducts in in vitro transcription 的研究论文。
在体外转录（IVT）过程中双链RNA（dsRNAs）和其他副产物的产生受催化循环中T7 RNA聚合酶构象的影响。T7 RNA聚合酶介导的转录包括三个不同的阶段：起始、延伸和终止。在启示过程中，T7 RNA聚合酶的N端结构域（NTD）与启动子序列结合，形成起始复合体（IC）。这种起始复合物是不稳定的，会产生短RNA转录本（长度为2-10个核苷酸）。转录本长度大于~10个核苷酸时，NTD中的启动子结合残基重新排列，释放DNA启动子区域，形成一个稳定的、过程性的酶延伸复合体（EC）。终止则发生在对特定信号序列的响应或到达线性化DNA模板末端时，这个过程被称为“失控转录”，通常会产生全长RNA，但有时会在其3'端产生非模板的附加物。此外，T7 RNA聚合酶还具有以RNA为模板的转录能力，从而形成双链RNA（dsRNAs）产物和回环dsRNA产物。
双链RNA（dsRNAs）分子是先天免疫反应激活因子，能够被RIG-I、MDA5和LGP2等识别，从而触发机体的天然免疫反应。因此，这些dsRNA分子会影响mRNA产物的效力和安全性，需要额外的纯化步骤从最终的mRNA产物中去除dsRNA。通常需要通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对mRNA产物进行下游纯化去除dsRNA，但这是一个昂贵且耗时的步骤。
朱斌课题组利用近年来爆发性增长的环境微生物基因组资源报道了新世纪以来所有的新型噬菌体单亚基RNA聚合酶的发现和开发工作，包括Syn5 RNA聚合酶、KP34 RNA聚合酶和VSW-3 RNA聚合酶，已形成国际特色研究方向。
该研究工作报道的是来自云南香格里拉高原季节性湿地冰湖纳帕海的VSW-3 RNA聚合酶。由于其对RNA和DNA末端结合能力的特点，VSW-3 RNA聚合酶在体外转录中有效降低了T7 RNA聚合酶以RNA为模版的末端延伸和依赖DNA末端的转录起始，因此T7产物中显著存在的末端双链RNA和全长双链RNA在VSW-3产物中几乎检测不到，极大提高了体外合成RNA的纯度，尤其适用于体内应用的RNA如mRNA药物和疫苗。
同时VSW-3 RNA聚合酶的低温合成以及对第二类T7转录终止子的不敏感特性进一步提高了RNA合成纯度。
华中科技大学生命学院博士后夏恒及博士研究生余兵兵为论文第一作者，华中科技大学为论文第一单位，华中科技大学生命学院教授朱斌为通讯作者。本研究受到国家自然科学基金原创探索项目及深圳市基础研究重点项目支持。
论文链接：
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15476286.2022.2139113
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