调控人类肝细胞命运的关键通路

撰文 | 陈文强

责编 | 兮

肝脏与人体健康息息相关，这是因为多种重要生理功能均由肝脏执行，如分解血液毒素、代谢存储、脂质/糖代谢及分泌血清蛋白等。肝 (实质) 细胞 (hepatocytes) 是执行这些重要生理功能的主要细胞类型。肝脏有多种细胞类型能帮助支撑肝功能，如作为肝脏组织特异的巨噬细胞——库否细胞 (Kupffer cell) 主要负责肝稳态和免疫功能，而肝卫星细胞则主要负责螯合维生素A。尽管有多项单细胞转录组研究对成年肝脏细胞分子图谱进行了细致绘制【1-4】，然而，我们对胚胎发育过程中肝细胞的单细胞转录组研究仍然较为缺乏。

为研究调控人类肝脏发育和成熟中的重要机制，近日，来自英国剑桥大学Wellcome-MRC干细胞研究所的Ludovic Vallier课题组的研究人员在Nature Cell Biology杂志在线发表了题为Single-cell atlas of human liver development reveals pathways directing hepatic cell fates的研究论文，通过比较人类胚胎及成熟干细胞的单细胞转录组，描绘了肝脏细胞的发育轨迹，鉴定了多个帮助肝脏细胞功能成熟的机制，从而更好地帮助我们利用肝脏细胞类型多样性来开发新的临床治疗手段。

首先，研究人员使用基于液滴技术的单细胞测序，对近24万处于不同发育阶段 (HB1、HB2、FH1、FH2及成年干细胞) 的肝脏细胞进行了研究，确定了组成肝脏的主要细胞类型(图1)——包括肝管细胞、内皮细胞、库否细胞、肝卫星细胞等。这些细胞在受孕后周 (post-conceptional weeks, PCW) 的表达时期也得到了确认。这些数据均已上传至云端，供研究者们访问 (https://collections.cellatlas.io/liver-development)。

图1. 人类肝脏发育的单细胞转录图谱

研究人员使用这一数据库检测了每个细胞类型的发育轨迹，确定了每个细胞类型的独特转录组特征(图2)，首先，肝脏细胞在组织发生过程中展现出渐进的功能成熟特征。其次，研究人员对除肝脏细胞外的其他几个主要肝细胞类型的发育轨迹，包括肝管细胞、内皮细胞、库否细胞、肝卫星细胞等也进行了一一深入研究 (详见原文图2)。

图2. 肝细胞在不同发育阶段的特征基因及相应GO功能分类

对肝卫星细胞的胚胎来源进行进一步研究，研究人员发现有三群细胞分别表达间叶细胞标记物、内皮细胞标记物及间叶细胞/内皮细胞标记物，提示胎儿内皮细胞及卫星细胞可能来源于这群卫星细胞-内皮细胞前体 (定义为SEpro细胞) 。研究人员随后用体外分化的hPSC进一步验证了这群细胞的存在，确定了肝卫星细胞生成过程中的关键特征。

研究人员从单细胞测序研究中观察到肝脏早期发育阶段HB1、HB2的肝原细胞表达WNT通路基因，表现出肝脏干细胞的某些特征。因此，研究人员使用肝细胞类器官(Hepatoblast organoids, HBO)模型进行进一步研究(图3)，发现HB2阶段的肝细胞能在体外生长并维持分化成肝细胞及胆管细胞的特性。

图3. 使用肝细胞类器官研究早期肝细胞来源及分化

研究人员使用CellPhoneDB数据库【5-6】，捕捉到了肝细胞与其他肝细胞类型 (卫星细胞、库否细胞及内皮细胞) 的相互作用，从而更好地理解指导肝组织发生的机制。例如，内皮细胞表达的NOTCH4/DLL4能与肝细胞上的DLK1/NOTCH2相互作用，而卫星细胞可通过激活WNT通路来支持肝细胞的自我更新。研究人员随后进一步使用类器官验证了这些结果。

最后，为了验证本文生成的scRNA-seq数据库，研究人员使用人源多能干细胞 (hPSCs) 分化实验来研究肝细胞成熟过程(图4)。研究人员通过新一轮的scRNA-seq研究比较了由hPSCs 分化成的D23天的未成熟肝细胞样细胞 (HLCs) 和D33天的HLCs(图4)，结果表明可以在胚胎期后通过天然发育途径偏移hPSCs分化的原定轨迹，从而防止生成成熟细胞。进一步研究表明，在HLC分化阶段，发育调控的关键因子的表达偏失是肝细胞样细胞无法发育成成熟干细胞的原因之一。

图4. 验证肝细胞分化过程中的转录因子

本文对人类肝脏发育的过程提供了细致的分子图谱，表明肝脏细胞的发育轨迹受肝脏所处的环境影响。出生后的肝脏的激活代表着细胞完全成熟的另一个关键改变。本文的数据建立了肝细胞和胆管细胞的逐步分化起源于实质和非实质细胞间的相互作用，其中卫星细胞的关键作用应得到进一步的深入研究。本研究通过单细胞分析和体外hPSC验证实验，证明了这两种研究技术的结合对于理解器官发育具有重要研究价值，从而更好地帮助我们了解其他器官的发育过程，理解重大疾病的细胞类型多样性，最终帮助我们更好地进行这些疾病的细胞治疗。

https://doi.org/10.1038/s41556-022-00989-7

制版人： 十一

参考文献

1. Aizarani, N. et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors.Naturehttps://doi.org/10.1038/s41586-019-1373-2 (2019).

2. MacParland, S. A. et al. Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.Nat. Commun.9, 4383 (2018).

3. Ramachandran, P. et al. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.Naturehttps://doi.org/10.1038/s41586-019-1631-3 (2019).

4. Segal, J. M. et al. Single cell analysis of human foetal liver captures the transcriptional profile of hepatobiliary hybrid progenitors.Nat. Commun.10, 3350 (2019).

5. Vento-Tormo, R. et al. Single-cell reconstruction of the early maternal–fetal interface in humans.Nature563, 347–353 (2018).

6. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A. & Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell–cell communication from combined expression of multi-subunit ligand–receptor complexes.Nat. Protoc. 15, 1484–1506 (2020).

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