【有机】Wender组Nat. Chem.：抗癌药EBC-46及其类似物的克级规模半合成

导读：

最近，美国斯坦福大学Paul A. Wender课题组报道了抗癌药Tigilanol Tiglate（EBC-46）及其类似物的实用性半合成路线。该合成工作是以廉价易取的佛波醇（phorbol）作为原料，经12步高效反应实现EBC-46的克级规模半合成（总产率12%，平均每步产率>80%）。相关研究成果发表在近期的《自然-化学》上（Nat. Chem. DOI: 10.1038/s41557-022-01048-2）。

背景介绍（Fig. 1）：

蛋白激酶C（PKC）是一个重要的药物靶点。目前，调节PKC靶点配体所涉及治疗方法包括：HIV治疗、CAR-T疗法、阿尔茨海默氏病和多发性硬化症的治疗等。其中部分PKC调节剂已经进入临床研究阶段，例如tigilanol tiglate（1, EBC-46, Fig.1）。EBC-46是一种从自然界获取的tigliane类二萜天然产物，可以通过调节PKC靶点治疗多种癌症。瘤内注射EBC-46可以诱发肿瘤的快速消融。给药后，EBC-46可通过诱发局部免疫反应和肿瘤破裂导致肿瘤细胞出血性坏死，随后清除实体瘤并促进伤口愈合。最近，FDA批准了EBC-46（商品名Stelfonta）用于治疗犬类非转移性肥大细胞肿瘤（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-intratumoral-injection-treat-non-metastatic-mast-cell-tumors-dogs）。最近一项犬类临床研究显示，在瘤内注射第一剂EBC-46后能观察到75%的完全反应。注射第二剂后能观察到88%的缓解，这促使EBC-46人体评估试验的开展。

（Fig.1，来源：Nat. Chem.）

目前，EBC-46的唯一来源是一种生长在澳大利亚的热带大戟科树木，一种雌雄异株红木树（blushwood tree）Fontainea picrosperm的种子。此种树木数目稀少且EBC-46提取率低（5%）。为了深入研究EBC-46的药用价值，需要多样化的原料来源。最近，美国斯坦福大学Paul A. Wender课题组以廉价易取的佛波醇（phorbol）为原料，实现了EBC-46及其类似物的克级规模半合成（Fig. 1）。

合成及生物活性研究（Fig. 2-4）：

如Fig.2a所示，EBC-46和相关活性tigliane、daphnane类天然产物具有类似的AB环，特别是B环上具有相同的5β-羟基-6α,7α-环氧官能团（黄色强调部分）。药效团模型发显示，AB环上C3、C4、C5、C20位氧原子能和PKC通过氢键作用相互连接，因此能够影响PKC的亲和力、选择性和功能（Fig. 2b-2c）。但是，选择性氧化C5位烯丙基难度极大（存在C8、C20、C10、C19四个非理想烯丙基部位），且佛波醇对热、光、酸、碱和空气氧化敏感的特征进一步加重了反应难度，因此直接C-H活化氧化C5位的尝试都未能成功。为此，作者采取了间接方法实现相关氧化态的构建（Fig. 3）。

（Fig. 2，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S2 in SI，来源：Nat. Chem.）

作者首先通过索氏提取法萃取巴豆种子（~$40 kg –1 ）得到佛波酯，所得佛波酯再经酯水解即可大规模获取所需佛波醇（2）（可从3 kg种子中获取>10 g佛波醇，Fig. S2）。如Fig. 3所示，佛波醇经两步反应乙酰化C12、C13位羟基得到双乙酰产物3。3经关键的光激发单线态氧的ene反应氧化成过氧化氢中间体，再经硫脲原位还原转化成烯丙位氧化产物4（Rose bengal, O 2 , CD 3 OD, 535 nm LED, 20 °C; then thiourea）。对于该关键氧化反应，小规模反应（<500 mg）可通过简单的反应瓶光照下搅拌实现；大规模反应（克级和十克级）可以使用循环流式反应装置实现（Fig. S3-S4）。对于C5位β-羟基的引入，作者最初尝试利用铼催化的烯丙位转化，直接将4转化成6或7，但未能实现，只得到少量非理想的C5α-羟基-C6,C20烯烃。因此，作者转向采取间接法。4首先经m-CPBA氧化，在烯烃双键位阻较小的β面发生环氧化得到产物5。5经NMI催化C20位羟基选择性Ts化和碘化钠促进的开环消除反应，得到理想产物C5β-醇6。6经筛选出的选择性铼催化1,3-烯丙醇转化条件（Table S1），转化成所需C5β-羟基佛波醇双乙酰化物7。直接环氧化7的烯烃双键会在位阻较小的β面发生反应，得到非理想产物。为此，作者将7用丙酮叉保护，改变B环构象，得到化合物8。8经筛选出的DMDO环氧化反应条件（Table S2），转化成理想的α-环氧化物9（DMDO的实验室大规模制备装置见Fig. S6）。9脱去乙酰基后，经选择性的两次酯化反应和脱丙酮叉反应即可转化成EBC-46（一批可得1.127 g），完成其克级规模半合成。

（Fig. 3，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S3 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S4 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Table S1 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Table S2 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S6 in SI，来源：Nat. Chem.）

为了确定EBC-46中C5β-羟基、C6α,C7α环氧和C12,C13酯基官能团在PKC亲和力和选择性方面所起的作用，作者将Fig. 3的中间体进行转化（详见SI），得到如Fig. 4a所示3个EBC-46的类似物SUW400（13）、SUW401（14）、SUW402（15）。3个类似物和EBC-46与PKC-β i 和PKC-θ的亲和力测试（Fig. 4b）显示，不含C6α,C7α环氧的SUW400具有和EBC-46类似的PKC亲和力和选择性，不含C12,C13酯基的SUW401不具有PKC亲和力和选择性，不含C5β-羟基的SUW402虽具有强效PKC亲和力但选择性差。因此，作者认为C5β-羟基和C12,C13酯基官能团是分子与PKC结合的必须官能团，C6α,C7α环氧是结合的非必须官能团。作者同时进行了体外实验，通过PKC-GFP（绿色荧光蛋白标记PKC融合蛋白）从细胞胞浆到细胞膜的转位实验（PKC激活标志），测试相关活性分子实时渗透CHO-K1（中国仓鼠卵巢因子K1）细胞并转位的能力，并同已知PKC抑制剂Bryostatin 1进行对比。体外实验显示EBC-46和更易合成的活性分子SUW400（13）、SUW402（15）有类似的转位能力，都能在低浓度（200 nM）下显示出中等PKC-β1-GFP转位，而在高浓度（1000 nM）下显示出强转位（Fig. 4c和Fig. S8-S10），且在高浓度（1000 nM）下EBC-46引起的转位要优于Bryostatin 1（Fig. S10）。

（Fig. 4，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S8 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S9 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S10 in SI，来源：Nat. Chem.）

（Fig. S11 in SI，来源：Nat. Chem.）

总结：

总之，Paul A. Wender课题组以廉价易取的佛波醇为原料，实现抗癌药EBC-46及其类似物的克级规模半合成。该研究工作备受赞誉，有助于EBC-46及其类似物在多种癌症治疗方面的药用价值研究。

论文信息：

Practical synthesis of the therapeutic leadstigilanol tiglate and its analogues

Paul A. Wender*, Zachary O. Gentry, David J. Fanelli , Quang H. Luu-Nguyen, Owen D. McAteer and Edward Njoo

Nat. Chem. DOI: 10.1038/s41557-022-01048-2

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