肿瘤基因检测十问十答！

肿瘤基因检测，对于业内人士来说，从来就不是什么“高大尚”的技术；但是，对于医生或患者来说，那可就真的是“既熟悉又陌生”的高科技技术！

1，什么是肿瘤基因检测呢？

肿瘤基因检测，顾名思义，就是针对与肿瘤相关的基因进行检测的一门技术。目前的市场上，肿瘤基因检测的产品方向主要有以下几种：

1，肿瘤易感基因检测：主要检测遗传多态性，这类产品的特点是频率高，致病性低，通常不直接致病，而是增加患病的风险；

2，遗传性肿瘤基因检测：主要检测胚系突变，这类产品的特点是频率低，致病性高，一旦携带有这种突变，则得病的概率非常高，可能在50%以上，甚至于100%；

3，肿瘤精准用药基因检测：主要包括化疗、靶向及免疫等药物。化疗药物基因检测比较简单，主要检测人体正常细胞的基因多态性（除了肿瘤组织的基因表达量），而不是测肿瘤细胞的基因突变，所以化疗药物基因检测还不能算是完全意义上的精准医疗，因为没有涉及对肿瘤细胞基因突变的分析；靶向药物基因检测通常会检测肿瘤信号通路中特定基因的点突变/插入缺失/拷贝数变异/融合（结构变异）情况，从而找到对特定患者有效的药物或方案，算是真正意义上的精准医疗；免疫药物基因检测主要还是检测与免疫治疗相关的生物标志物，比如TMB，PD-L1，MSI，MMR，HLA等，以期指导免疫治疗；

4，肿瘤早期筛查基因检测：通过液体活检技术对ctDNA（甲基化）进行检测，在肿瘤早期或超早期的时候就能够发现基因水平的变化，从而达到早筛查，早发现，早诊断及早治疗的目的；

5，肿瘤预后预测、疗效评估等基因检测...

2，panel到底是个啥东西？

Panel 其实是NGS（二代测序，高通量测序技术）技术发展起来的一个词语，主要指同时检测多个基因、多个位点。基因检测的 Panel 官方称之为“基因包”，也可以称之为“基因组合”，商业化的市场习惯称之为“基因套餐”。

就基因 Panel 本身来说，其实并没有指明所检测的基因数目应该是多少。几个基因可以是一个 Panel，几十个基因也可以是一个 Panel，几百上千个基因也可以是一个 Panel。就 Panel大小来说，不仅需要看检测基因的数目，还需要看基因所覆盖的区域大小。

3，说到肿瘤基因检测Panel，通常都会提及 测序覆盖度、测序深度、有效测序深度、灵敏度、特异性、检测限，这些到底是个啥？

测序覆盖度指测序获得的序列占整个 panel 基因组 size 比例。由于 Panel 基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。比如一个肿瘤panel测序，覆盖度是99%的话，那么还有1%的序列区域是没有通过测序获得的，Gap就是1%。

测序深度指测序得到的总碱基数/待测基因组大小，它是评价测序量的指标之一。假设一个 panel 的 size 为 2.0M，测序深度为 500X，那么获得的总数据量为 1.0G。它的测序深度=总数据量 1.0G/panel 大小 2.0M=500X）。

有效测序深度：不等同于测序深度，是指可信的去除重复序列（dup）后目标区域的平均深度。比如 2.0M 的 Panel Size，下机数据量1.0G，有50%数据落在目标区域（on target），50%为重复序列，那么其测序深度为500X （1.0G/2.0M）,有效深度仅为125X（1G*50%*50%/2.0M）。

灵敏度( sensitivity) ：指患者中试验阳性者所占比例。对应假阴性率。计算公式：灵敏度( Sen) = a/( a+ c) % 。

特异度( specificity) ：指没有患病的人中试验阴性者所占比例。对应假阳性率。计算公式：特异度( Spe) = d/ ( b+ d) % 。

灵敏度和特异性计算参考表

检出限（LOD）：Limit of detection，是指样品中分析物可被检出的最低的含量，此项指标体现了试剂检测的分析灵敏度。

4，提高测序深度会不会提高检出限（LOD）？

提高测序深度可以增加检测灵敏度、特异性，同时提高检出限，但不能突破极限检出限。在DNA量一定的情况下，满足一定量测序深度后，检出限存在理论极限值，单纯通过增加测序深度并不能降低检出限，盲目加大测序深度只会产生更多的重复（duplication），造成数据浪费，所以测序深度并非越深越好。比如 ctDNA上样量为 33ng（10000拷贝），文库构建转化率50%，就是5000个拷贝，测序深度增加再深，理论上最多也只能测出5000个拷贝，LOD也不可能达到万分之一的。

5，肿瘤基因检测技术中，对于Reads，Raw Reads及Clean Reads是如何进行理解的？

Reads：高通量测序平台产生的序列就称为reads。

Raw Reads：原始下机数据称为Raw Reads（Raw data）。

Clean Reads：通过生物信息的方法，去除一些质量差的reads（比如测序错误，长度小于20的reads，接头序列，UMI序列等），得到Clean Reads（Clean data）。

6，肿瘤基因检测，对于新鲜组织、石蜡切片、胸腹水、外周血样本类型应该如何选择呢？

毋庸置疑，组织应该是金标准，有组织的情况下，肯定组织优先。按照检出率的话，新鲜组织>石蜡切片>胸腹水上清>胸腹水细胞>外周血。不过做肿瘤基因检测的话，最主要的还是要考虑临床取样的便捷性！

7，无法取到组织的时候，什么情况下才适合用外周血进行基因检测呢？

无法取得组织的话，最好是临床处于中晚期（临床III期后）的患者才适合用外周血进行基因检测，同时，外周血ctDNA检测最好是在没有经过任何治疗之前进行采血检测，放化疗和靶向治疗均会对外周血ctDNA检测结果产生影响。

8，在使用肿瘤大panel做肿瘤用药或TMB检测的时候，是否需要提供外周血作为对照呢？

最好提供外周血进行对照，这样可以确保检测出的基因变异都是肿瘤细胞特有的。有的公司是通过公共的SNP数据库进行过滤，比如1000g，ExAC_ALL，gnomAD，这些SNP数据其实绝大多数都是外国人的，中国人群自己的SNP数据则是非常少的，如果保证种系变异能够精准的过滤，最好还是提供外周血作一个对照吧！

9，做肿瘤基因检测的话，是不是panel越大越好呢？

其实，每种肿瘤基因检测产品（大中小panel）都有自己的优势，在真正选择产品的时候建议大家根据经济条件及患者的情况来选择。比如刚确诊的时候，可以选择几个/几十个基因的panel来进行检测。但是如果晚期多处转移的时候，尤其是耐药的患者，基因突变比较复杂紊乱，可以选择更大的基因panel去检测。如果需要进行免疫治疗，想检查TMB，MSI及MMR的情况，也可以选择大panel进行检测，总之一句话，根据具体的情况来吧，比如肿瘤的类型，检测的目的及意义，经济压力，消费能力等。

10，是不是所有的靶向药在用药前都需要做肿瘤基因检测？

不是的，这个之前也说过很多次。目前有接近一半的的靶向药，比如CDK4/6靶点的靶向药，索拉非尼、瑞戈非尼、卡博替尼等多靶点的抗血管生成靶向药物，使用前无需做基因检测。大家也可以去翻阅 2018年9月21日，国家卫健委（原国家卫计委）发布的《新型抗肿瘤药物临床应用指导远侧（2018年版）》。

不过，对于有明确疗效/耐药靶点的药物，须遵循基因检测后才可使用！不得在未做相关基因检测的情况下盲目用药哦！！！

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