Nature：首例光酶催化对映选择性[2+2]-环加成反应

导读

近日，英国曼彻斯特大学的Anthony P. Green教授团队和华中科技大学的钟芳锐、吴钰周教授、西北大学陈希教授团队分别独立提出“三重态光酶”概念，利用合成生物学技术开发了一类全新的人工酶，并成功将其应用于光化学对映选择性[2+2]环加成反应。本文简要介绍Anthony P. Green教授的工作，华中科技大学的工作参考化学加20220923推送（）。

正文

利用光催化三重态能量转移(EnT)可以实现很多基态下无法进行的反应，例如环加成、电环化反应、去外消旋化、迁移和重排等。[2+2]-环加成反应作为最经典的光化学反应之一，被应用于众多含四元环化合物的合成中。与类似的Diels-Alder [4+2]-环加成相比，[2+2]-环加成由于不匹配的基态轨道对称性而被热禁阻(图 1A)。EnT光催化的作用机制如图1B所示，三重态光敏剂首先在光激发下由基态(S0)跃迁至单重激发态(S1)，再通过系间窜跃转化至激发三重态(T1)。由于从T1 到S0的弛豫是自旋禁阻的，因此T1相对于S1具有更长的寿命。随后，光敏剂T1态在自旋允许下与底物发生能量转移，自身返回S0，同时将底物由S0激发为具有高反应性的T1。常用的三重态光敏剂包括共轭芳香酮，例如二苯甲酮、氧杂蒽酮和噻吨酮等。

图1. 光化学[2+2]环加成反应（图片来源：Nature）

近年来，化学家们通过将非手性光敏剂与非光敏性手性催化剂结合(图 1C)或直接使用手性光敏剂(图 1D)，成功开发了一些不对称光化学反应。然而这些方法并不能作为实现对映选择性光化学合成的通用解决方案，很多理想的光化学过程不适用于对映选择性催化。此外，这些反应通常都对氧敏感，同时需要较高催化剂载量，且底物适用范围狭窄。酶作为自然界中经历漫长演化而形成的生物催化剂，具有普通化学催化剂难以企及的高催化活性，但一种酶通常只适用于某一特定的底物或天然生命化学反应，难以满足人们生产生活中对多样性化学品的合成需求。近年来，随着合成生物学的快速发展，人们目前已能实现在蛋白中人为设计和引入非天然活性中心构建人工酶，极大地拓展了酶的催化反应性。理论上酶的活性位点可以为对映选择性光化学反应提供更有利的手性环境。通过定向进化，可以改造这些活性位点以最大限度地提高蛋白、底物和光敏剂之间的相互作用，从而提供高效、高选择性的光催化剂(图 1E)。截至目前，已有少数天然光酶和工程生物酶得到了应用，而能介导对映选择性EnT过程的酶仍然没有报道。

光酶的设计与进化

首先，作者进行了选择性光酶的开发研究，他们以通过计算设计的 Diels-Alderase DA_20_00作为主体骨架。DA_20_00的活性位点包括设计的氨基酸残基(Tyr121和Gln195)，用于促进Diels-Alder 反应，同时也可能用于[2+2]-环加成的催化。这些残基嵌入一个大的疏水空腔中，可容纳体积庞大的芳香光敏剂(图 2A)。为了实现其光催化活性，作者使用工程改造的詹氏甲烷球菌酪氨酸-tRNA合成酶/酪氨酸-tRNA (MjTyrRS/MjtRNATyr)在DA_20_00活性位点周围的几个位置引入4-苯甲酰苯丙氨酸(BpA)，实现小分子光敏剂苯甲酮与蛋白的共价连接。作者使用喹诺酮1作为分子内[2+2]-环加成的模板底物，以二苯甲酮(BP)为光敏剂，在光照条件下能得到外消旋直链产物1a和交叉链产物1b的区域异构体混合物，比例为1.4：1(图 2B, 2C)。通过将BpA引入DA_20_00 疏水空腔内的173号位可以得到第一代活性光酶EnT1.0，其催化活性和选择性优于BP，产物1a和1b的比例为2：1，同时主产物(-)-1a的e.e.值达到46%。

图2. 第一代光酶EnT1.0的发展（图片来源：Nature）

为了提高 EnT1.0 的活性，作者首先将 BpA173附近的 8个残基突变为丙氨酸得到光酶EnT1.1。其催化活性相对于第一代显著提高，1a的产率增加3倍，同时e.e.值提升至60%。随后作者进行进一步定向进化策略研究，其包括两轮饱和突变，即分别针对活性位点和氨基酸残基进行迭代优化，通过使用 NNK 简并密码子单独随机化。在添加底物1的条件下，使用365 nm LED阵列将排列在96 孔微量滴定板中的各个样本照射30分钟，通过高通量超高效液相色谱法(UPLC)分析产物，随后通过 DNA重组技术将在每一轮中确定的有益突变结合起来(图3 A)。在对约 3500个样本进行评估后，作者成功发现了光酶EnT1.3，其活性、稳定性和选择性都得到了显著改善(图3 B)。EnT1.3包含五个突变(EnT1.0 M90A Q149D P196R K225E A229S，与 EnT1.0 相比，底物1到1a的转化率提高了10倍，选择性从1a：1b= 2：1提升至9：1，同时主产物(-)-1a的e.e.值 > 99% (图3C和3D)。值得注意的是，EnT1.3 在4 °C下比在室温下催化活性更高，这可能是由于低温能提高光敏剂三重态的寿命所致。

图3. 手性光酶的迭代优化（图片来源：Nature）

相比于三重态易被氧气淬灭而失活的小分子光敏剂相比，EnT1.3 则可以耐受需氧缓冲液(图 3D)，并具有较高的TTN值。激光脉冲实验也表明酶结合的 BpA生色团的三重态寿命在需氧和厌氧缓冲液中相差无几，这与溶液中三重态二苯甲酮的氧敏感性形成鲜明对比。另外，仅使用1.5 mol% EnT1.3，即可在2 小时内将1几乎完全转化为光学纯的(-)-1a，表现出很高的催化效率。

光酶催化[2+2]环加成反应

随后作者研究了EnT1.3对含烯基喹诺酮衍生物的不对称[2+2]-环加成反应的光催化活性(图4，2a-13a)。大多数底物都能以较高的转化率和选择性得到环加成产物，对于底物3、8和12，偕二甲基部分的引入会导致对映选择性降低，这可能是由于EnT1.3活性位点和底物之间独特的结构互补性所致。值得注意的是，含六元环并四元环结构的2a和7a也能以高对映选择性和较高收率获得，由于六元环的环化过程相对较慢，普通的小分子光敏剂难以实现此类底物较好的反应选择性。对于N-甲基喹诺酮底物13而言，EnT1.3的催化选择性较为一般，得到13a和异构体13b的混合物(2:1 r.r.，13a的e.e.值为36%)。作者通过向EnT1.3中引入Y121F突变能显著改善光酶的催化活性和选择性(13a的选择性可提升至4:1 r.r.，78% e.e.)，再利用定向进化确定S271C的迭代，得到EnT1.3 Y121F S271C，最终能以8:1 r.r., 98% e.e.获得13a。这项工作表明光酶的催化能力可以通过调控蛋白活性位点得到改善，能实现一些现有小分子光催化体系难以适用的选择性转化。最后，为了扩大合成应用，作者探索了 EnT1.3在2-喹诺酮的分子间[2+2]-环加成中的应用，结果表明在使用甲基乙烯基酮或乙基乙烯基酮作为环加成底物的分子间反应中，EnT1.3都能表现出优异的催化活性和选择性，能以97% e.e.值得到光学纯产物14和15。

图4. 光酶催化对映选择性[2+2]环加成（图片来源：Nature）

光酶的结构与催化机制

为了深入了解 EnT1.3 催化机制，作者解析了产物 (-)-1a与C-末端截断类似物(EnT1.3ΔC310-314)的配合物晶体结构(图 5)。这种截断类似物对催化活性或选择性的影响可以忽略不计。在该结构中，(-)-1a位于一个合适的活性位点空腔中，其芳香环夹在His287和二苯甲酮侧链之间(距离分别为3.6 Å和3.8 Å，图 5)。这种夹心结构能实现从激发态光敏剂到母体底物的有效三重态能量转移。随后作者又考虑使用非共价二苯甲酮光敏剂是否也能实现EnT1.3的对映选择性催化，实验结果表明在外源二苯甲酮存在下，EnT1.3 BpA173Ala催化的反应转化率和选择性都显著降低，表明在遗传水平向酶上共价连接三重态光敏剂是高催化性能的重要来源。另外，晶体结构表明，Trp244可能在控制反应选择性上发挥重要作用，其通过构造活性位点空腔来抑制环外烯烃加成到激发态的喹诺酮的对映体表面，从而有利于(-)-1a的生成。W244A突变则会导致催化活性显著降低并得到大量外消旋产物。喹诺酮N-H的氢键受体Tyr121和喹诺酮羰基的氢键供体Gln195之间的互补氢键相互作用能进一步有利于(-)-1a的结合。对于底物1，Tyr121突变为Phe会导致催化活性降低3倍，同时对映选择性降低，但却能提高对N-甲基化底物13的催化活性和选择性(图 4)。作者认为N-甲基取代基可能占据了由于去除Tyr121酚氧而空出的位置。另外，从Gln195到喹诺酮羰基的氢键距离仅为2.6 Å，这可能会有效降低底物的三重态能量，将Gln195突变为Ala也导致活性和选择性显着降低，进一步证明了其对 EnT1.3催化性能的重要影响。值得注意的是，在apo-EnT1.3中，Gln195和Arg196具有明显不同的取向，而Arg196与Asp149和Glu225都存在相互作用，这表明底物的结合可能会诱导形成独特的Arg196-Gln195-底物氢键网络。这种独特的结合方式首次揭示了控制高效能量转移催化的活性位点特征，并为未来设计具有独特功能的光酶提供了重要指导。

图5. EnT1.3ΔC310-314与产物(-)-1a的配合物晶体结构（图片来源：Nature）

总结

Anthony P. Green教授团队基于有机合成、基因工程、酶理论计算和结构生物学等交叉研究背景，将小分子光敏剂二苯甲酮通过基因密码子拓展技术插入到蛋白的手性空腔中，构建了含非天然催化活性中心的人工光酶。通过突变迭代优化酶的氨基酸残基和空腔结构，完成了光酶的定向进化，最终获得了优异的突变体Ent 1.3。该光酶能高效催化喹诺酮衍生物的分子内或分子间不对称[2+2]环加成反应，具有优异的底物普适性和手性选择性。另外，作者还通过解析光酶与(-)-1a配合物的单晶结构，阐明了其优异的催化性能主要来源于光敏剂和周边关键氨基酸残基与底物之间的氢键等弱相互作用。

文献详情：

Jonathan S. Trimble, Rebecca Crawshaw, Florence J. Hardy, Colin W. Levy, Murray J. B. Brown, Douglas E. Fuerst, Derren J. Heyes, Richard Obexer & Anthony P. Green. A Designed Photoenzyme for Enantioselective [2+2]-Cycloadditions. Nature. 2022. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05335-3