陕中医大:基于PI3K/PDK1/Akt信号研究丹参-红花药对对寒凝血瘀型心肌缺血大鼠的保护作用及机制

缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）的发病率及死亡率逐年上升，给国家和人民带来沉重的经济负担，已成为全球性的公共卫生问题[1-3]。现代医学针对IHD主要采用药物干预及手术治疗，然而手术治疗可能出现心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R），造成不可逆的心肌二次损伤[4-5]。中药已有上千年的药用历史，能够有效地缓解IHD患者的症状，其多成分、多靶点治疗的特点及整体观念对病理机制复杂的IHD展现出较好的临床疗效[6-7]。

现代药理学研究表明，丹参具有改善微循环、增加冠脉血流、扩血管、清除自由基、抗炎、抗氧化、抑制血小板凝集等作用，临床常用于治疗心肌缺血、心肌梗死、脑缺血等心脑血管疾病[8-12]。红花具有降压、抗炎、抗心律失常、抗氧化、抗肿瘤、抗缺血等作用，临床常用于治疗冠心病、心绞痛、脑血栓等多种心脑血管疾病[13-15]。丹参-红花常作为活血化瘀药对被广泛用于治疗冠心病、心绞痛等缺血性心血管疾病，其药理作用及临床疗效显著[16]。复方丹参滴丸由丹参、三七、冰片组成，具有活血化瘀之功效，用于治疗冠心病心绞痛等症，且po给药，与丹参-红花药对的功效、临床应用及给药途径均一致，本研究以复方丹参滴丸为阳性对照药物，采用盐酸异丙肾上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）构建急性心肌缺血大鼠模型，基于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路探讨丹参-红花药对对心肌缺血的保护机制。

1材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠60只，6周龄，体质量180～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（川）2020-030，动物质量合格证号0043215，实验动物使用许可证号SCXK（川）2020-030。动物饲养于陕西中医药大学药理实验中心的动物房，饲养环境为温度（25±2）℃，相对湿度（75±5）%，12 h光照/黑暗交替，普通饲料喂养，自由饮水。所有动物实验操作均在陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准下进行（批准号SUCMDL-20190309001）。

1.2药材

丹参饮片（产地山东，批号160821）、红花饮片（产地新疆，批号181012）购自安徽泽华国药饮片有限公司，经陕西中医药大学白吉庆教授鉴定分别为唇形科植物丹参Salvia miltrorrhiza Bge.的干燥根及根茎、菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，均符合《中国药典》2020年版规定。

1.3药品与试剂

复方丹参滴丸（批号202012）购自天津天士力制药股份有限公司；戊巴比妥钠（批号57-33-0）购自德国Merck公司；ISO（批号I5627-5G）、2,3,5-三苯基氯化四唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，批号T8877-100G）购自美国Sigma公司；苏木素（批号517-28-2）购自北京索莱宝生物科技有限公司；醇溶性伊红Y（批号15086-94-9）购自山东西亚化学工业有限公司；肌红蛋白（myoglobin，MB）检测试剂盒（批号ml016170）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK）检测试剂盒（批号ml076416）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒（批号ml-E5734）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（批号ml076592）、CK-MB检测试剂盒（批号ml-slisa-4870）、心肌肌钙蛋白-I（cardiac troponin-I，CTn-I）检测试剂盒（批号ml092662）、CTn-T检测试剂盒（批号ml076416）、C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）检测试剂盒（批号ml092609）、N末端利钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）检测试剂盒（批号ml028489）和B型脑利钠肽（B-brain natriuretic peptides，BNP）检测试剂盒（批号ml076416）购自上海酶联生物科技有限公司；TUNEL检测试剂盒（批号WLA029a）、BCA蛋白定量试剂盒（批号WLA004）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗体（批号WL01980）、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗体（批号WL02169）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号WL01556）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号WL01637）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号WL02117）、Caspase-9抗体（批号WL03421）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗体（批号WL01789）、Akt抗体（批号WL0003b）、p-Akt抗体（批号WLP001）、HRP标记的羊抗兔IgG抗体（批号WLA023）、β-actin抗体（批号WL01845）购自沈阳万类生物科技有限公司；p-eNOS抗体（批号9570）购自美国CST公司；细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗体（批号AC909）购自碧云天生物；PI3K抗体（批号ab191606）、p-PI3K抗体（批号ab182651）、PDK1抗体（批号ab90444）购自英国Abcam公司。

1.4仪器

KD-3358型切片机（浙江金华科迪公司）；显微镜（日本Nikon公司）；DYCZ-24DN型蛋白电泳仪、WD-9413B型凝胶成像系统（北京六一公司）；H-2050R型超速冷冻离心机（湖南湘仪公司）；BioTek ELx800型全自动酶标仪（美国Bio Tek公司）。

2方法

2.1丹参-红花药对的制备

本课题组前期研究发现，丹参-红花药对（3∶1）时疗效最佳，故按照质量比3∶1取丹参、红花饮片适量，加8倍量的水室温浸泡1 h，45 ℃浸泡提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，采用HPLC法测定干燥后粉末中主要成分丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的质量分数分别为4.70、17.20、1.76、4.58、55.18 mg/g。取适量粉末，加水溶解至质量浓度为1.6 g/mL（以生药量计）的溶液，作为高剂量组药液；按照2倍稀释得中、低剂量组药液。

2.2动物分组与给药

SD大鼠随机分为对照组、模型组、复方丹参滴丸（73 mg/kg）组和丹参-红花低、中、高剂量（4、8、16 g/kg，分别相当于临床剂量的1、2、4倍）组，每组10只。各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积纯净水，1次/d，连续7 d。于第6天开始ig药物1 h后造模，除对照组外，其余各组大鼠于0 ℃的冰浴中寒冷刺激4 min，然后sc ISO（85 mg/kg），1次/d，连续2 d。

2.3样本收集

末次sc ISO 12 h后，大鼠ip 2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血，离心，用于心肌酶以及心肌蛋白的检测；取出心脏，用于苏木素-伊红（HE）、TTC、TUNEL染色和相关蛋白检测。

2.4丹参-红花对模型大鼠心肌梗死的影响

取各组大鼠心脏，切开后快速将心室部分切片，经2% TTC溶液室温处理25 min，用10%福尔马林溶液固定。未梗塞的心肌被染成红色，而梗塞的心肌未被染色。数码相机拍照，输入电脑，用Image J软件分析染色切片的图像，计算梗死面积[16]。

2.5丹参-红花对模型大鼠心肌病理的影响

取固定的心脏，修块，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯处理后石蜡包埋，切片（5 μm），温水展片并移到载玻片上，烘干，依次放入二甲苯I、II中进行脱蜡，进行HE染色，滴加中性树胶封片。于显微镜下观察并拍照[12,16]。

2.6丹参-红花对模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

取固定的心脏，梯度乙醇处理后，二甲苯浸泡至标本透明，石蜡包埋，切片（5 μm），温水展片并移至载玻片上，烘干，依次以二甲苯、梯度乙醇和蒸馏水处理，PBS漂洗后，依次滴加0.1% Triton X-100、3% H2O2、TUNEL反应液、Converter-POD和DAB底物处理，PBS漂洗，浸入苏木素染色，自来水冲洗，浸入1%盐酸乙醇中处理，自来水冲洗，依次浸入梯度乙醇和二甲苯中处理，中性树胶封片。于显微镜下观察并拍照，并计算细胞凋亡率[12,16]。

凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数

2.7丹参-红花对模型大鼠心肌酶以及心肌蛋白的影响

按试剂盒说明书测定大鼠血清中CK、AST、LDH、CK-MB活性及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平。

2.8丹参-红花对模型大鼠PI3K/PDK1/Akt通路相关蛋白表达的影响

取各组大鼠心肌组织，切割成小块，液氮研磨，加入裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶，室温封闭2 h；分别加入NF-κB p65（1∶500）、p-NF-κB p65（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1000）、Caspase-3（1∶500）、Caspase-9（1∶500）、eNOS（1∶500）、p-eNOS（1∶500）、PDK1（1∶500)、Cyt C（1∶500）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶500）、PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、β-actin（1∶1000）抗体，4 ℃孵育过夜；分别加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体（1∶5000），室温孵育2 h，加入ECL试剂显色，暗室曝光。使用Gel Pro Analyzer软件分析条带灰度值。

2.9统计分析

所有数据以表示，采用SPSS 17.0软件进行统计和分析，采用单因素方差分析和组间独立样本t检验进行组间比较。

3结果

3.1丹参-红花对寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌梗死的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌梗死面积显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，复方丹参滴丸组和丹参-红花中、高剂量组大鼠心肌梗死面积均显著降低（P＜0.01）。

3.2丹参-红花对寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌病理的影响

如图2所示，对照组大鼠心肌形态结构正常，细胞排列整齐，染色均匀，胞核染清晰，纹理清晰，偶见心肌间质散在炎性细胞；模型组心肌形态结构紊乱，心肌细胞界限不清，心肌间质疏松、充血、肿胀，伴有多量炎性细胞浸润，肌纤维断裂，细胞核固缩、碎裂，有溢出，说明造模成功；与模型组比较，各给药组心肌形态结构均得到不同程度改善。

3.3丹参-红花对寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠心肌细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05、0.01）。

3.4丹参-红花对寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌酶及心肌蛋白的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠血浆中CK、AST、LDH、CK-MB活性及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血浆中CK、AST、CK-MB活性及CTn-T水平均显著降低（P＜0.05、0.01）；复方丹参滴丸组和丹参-红花中、高剂量组大鼠血浆中LDH活性及CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。

3.5丹参-红花对寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌组织PI3K/PDK1/Akt通路相关蛋白表达的影响

如图5所示，各组eNOS、NF-κB p65、PI3K、Akt、Caspase-3前体（pro Caspase-3）和pro Caspase-9蛋白表达水平无显著差异。与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中p-PI3K、PDK1、p-Akt、p-eNOS和Bcl-2蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），p-NF-κB p65、Bax、Cyt C、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）和cleaved Caspase-9蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠心肌组织中p-Akt和p-eNOS蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）；复方丹参滴丸组和丹参-红花中、高剂量组大鼠心肌组织中p-PI3K、PDK1和Bcl-2蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），Bax、Cyt C、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。

4讨论

机体功能性改变或器质性病变导致冠脉血流和心肌需求之间不平衡，会引起心肌缺血（主要包括急性心肌缺血和慢性心肌缺血），导致患者出现不同程度的心肌损害。引起IHD的原因较多，如血压波动范围大；心脏的血管畸形；冠脉硬化、闭塞、狭窄；情绪紧张、焦虑以及睡眠不足等。IHD可刺激心肌细胞凋亡，产生纤维化，促进心肌间质重构，损伤心脏，同时当心肌缺血时，血浆中心肌酶活性以及心肌蛋白水平会异常升高，长时间的缺血会引发心肌梗死。血浆中心肌酶活性以及心肌蛋白水平的异常升高、心肌细胞凋亡、心肌梗死面积被认为是评价急性心肌缺血的主要指标。CK、AST、LDH、CK-MB、CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP和BNP是心肌梗死早期诊断的敏感指标，心肌损伤发病6～9 h后血浆中上述指标出现增高并持续数天，

因此，上述指标对心肌损伤的敏感性和特异性都较高。虽然上述指标在心肌梗死后开始升高的时间和持续的时间存在差异，但在心肌梗死12 h后，上述指标仍处于异常水平，因此本研究在末次sc ISO后12 h取血测定上述心肌酶活性和心肌蛋白水平，结果显示，模型组CK、AST、LDH、CK-MB活性以及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均显著高于对照组，表明心肌梗死12 h后，上述指标仍处于异常水平。

中医中药治疗IHD有着几千年的经验积累，其治疗效果显著，越来越受到人们的重视，然而中药“方-证”的对应关系及其作用机制尚不明确。采用适宜的动物模型研究中医药理论是提高中医药临床疗效、提高中医诊疗水平、促进中医药发展和中药现代化的有效途径[17-18]。目前主要通过开胸结扎冠状动脉左前降支或药物诱导复制心肌缺血模型。然而开胸手术实验动物存活率低，实验难度大，要求技术人员要有丰富的心导管实验经验和娴熟的技术；药物诱导法操作简单，与人心脏阵发性疼痛的病理处境接近，ISO是常用的药物之一，复制的心肌缺血模型不但具有心绞痛的病理状态而且模型的病理状态稳定[19-20]。中医认为心肌缺血多为心脾肝肾虚，心脉失养，血瘀、寒凝、气滞，痹阻心脉，其中血瘀是病理关键[18,21]。本研究参考寒凝血瘀证动物模型[22]和心肌缺血动物模型[12]的制备，结合寒凝血瘀型心肌缺血疾病的冬季发病特点，采用ISO和寒冷刺激联合的方法，建立大鼠寒凝血瘀证心肌缺血模型，结果显示，模型大鼠爪尾部呈现紫色，身体蜷缩、少动，甚至出现寒战等症状，心肌组织病理、血浆中心肌酶活性和心肌蛋白水平与对照组比较均有显著性差异，表明建立的寒凝血瘀心肌缺血大鼠模型符合中医证侯特点，因此本研究参照文献方法[12,22]和前期实验积累，选用ISO同时联合寒冷刺激制备寒凝血瘀型的心肌缺血大鼠模型，研究丹参-红花活血化瘀药对抗心肌缺血的作用机制。

研究发现，PI3K/PDK1/Akt信号通路通过调节心肌细胞凋亡、血管内皮生成等保护心脏[23-24]。激活的PI3K不能直接使Akt磷酸化，需要和PDK1结合，最终激活Akt，活化的Akt可使eNOS磷酸化，进而促进内源性NO的产生。NO具有促进内皮再生、血管舒张等作用，从而改善动脉粥样硬化和冠心病引起的心肌缺血、缺氧或坏死；激活的Akt通过激活抗凋亡蛋白Bcl-2或激活NF-κB p65使其进入细胞核，转录抗凋亡基因，进而抑制细胞凋亡。研究表明，PI3K/Akt途径可以调控药物对ISO引起的心肌缺血性损伤的保护作用[25]。本研究发现，模型组大鼠心肌组织中PI3K/Akt通路被抑制，导致p-PI3K、PDK1和p-Akt蛋白表达水平降低；丹参-红花药对能够显著上调ISO诱导的p-PI3K、PDK1和p-Akt蛋白表达的降低。表明丹参-红花可能通过调控PI3K/PDK1/Akt信号通路来保护心肌缺血。

PI3K/PDK1/Akt信号通路能够通过调控Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族。Bcl-2蛋白家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，能够控制线粒体外膜的通透性，与细胞凋亡密切相关。线粒体释放Cyt C并激活Caspase-9，随后激活Caspase-3[26]。Caspase-3是凋亡的关键执行者，是Caspase家族的关键成员。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织中Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，进而诱发心肌细胞凋亡，与细胞凋亡的特征一致。TTC结果显示丹参-红花对ISO诱导的心肌缺血具有显著的抑制作用，进一步通过HE染色结果看出，模型组大鼠心肌细胞核出现皱缩等凋亡的现象，丹参-红花可以显著改善心肌细胞形态，推测丹参-红花能够抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡。为了验证此推测，本研究进一步通过TUNEL染色检测丹参-红花药对抗心肌细胞凋亡的作用，结果发现模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高，而丹参-红花药对能够显著降低ISO诱导的心肌细胞凋亡，证实了丹参-红花对ISO诱导的心肌细胞凋亡的保护作用。此外，Western blotting结果显示，模型组大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表达水平显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低；丹参-红花能够显著降低促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表达，升高抗凋亡蛋白Bcl-2表达，表明其可能通过调控凋亡蛋白表达，从而发挥抗ISO诱导的心肌细胞凋亡作用。

综上所述，丹参-红花药对能够通过调控PI3K/ PDK1/Akt信号通路，抑制心肌细胞凋亡，进而实现对心肌缺血的保护作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：王小平，薛志鹏，杜少兵，周慧慧，白吉庆，李 菁，王鹏飞，谢李红，陈 妮．基于PI3K/PDK1/Akt信号通路研究丹参-红花药对对寒凝血瘀型心肌缺血大鼠的保护作用及机制 [J]. 中草药, 2022, 53(16): 5083-5092 .

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