中国科学家实现用于肿瘤血管正常化和放疗增敏的一氧化氮“仓库”

在肿瘤放疗过程中，实体肿瘤的乏氧微环境会导致 DNA 损伤降低从而使肿瘤产生严重的放射抗性。

一氧化氮（NO）作为一种有效的放疗增敏剂，有两种作用方式：（1）它可以直接与 DNA 自由基反应，固定放疗造成的 DNA 损伤；（2）它能使异常的肿瘤血管恢复正常，增加血液灌注和氧供应。

为了充分发挥 NO 放疗增敏的功能，需要严谨的控制 NO 的给药剂量和持续时间，否则可能会导致相反的效果。因此需要找到一种同时满足这两个需求的 NO 递送策略。

▲图 | 刘鉴峰（来源：）

近日，中国医学科学院放射医学研究所、团队/南开大学课题组设计了一种超分子水凝胶 NO“仓库”（SupraNO），可控制 NO 的释放量和持续时间，达到肿瘤血管正常化和放疗增敏的目的。

实验证明，NO“仓库”可以在 B16 荷瘤小鼠体内持续提供低剂量 NO 从而使肿瘤部位血管正常化，并在辐射前大量释放 NO 以达到最大的 DNA 损伤效果。这两种治疗模式协同作用可以有效地增强 B16 肿瘤的放疗敏感性，比单一剂量 NO 治疗更有效。

近日，相关论文以《超分子一氧化氮库用于缺氧肿瘤血管正常化和放射增敏》（） 为题，发表于 Advanced Materials。中国医学科学院放射医学研究所研究员为论文第一作者。论文得到国家自然科学基金委的项目支持。

SupraNO 的设计和自组装

▲图 1 | SupraNO 仓库的示意图和表征。A） SupraNO 仓库可控递送 NO 及其在乏·氧肿瘤血管正常化和放疗增敏中的作用。B） SupraNO 的化学结构和 β-Gal 催化的 SupraNO 的化学反应。C） SupraNO (0.5 wt%） 的 TEM 图像。D）SupraNO （0.5 wt%)）在 37 °C 时的 G'和 G”值。E）SupraNO（0.5 wt%）在 37 °C 下从注射器中挤出后的 G'和 G"值。（来源：Advanced Materials）

SupraNO 溶液在加热后冷却形成微观形貌为纳米纤维的可注射水凝胶。分子设计决定了 β-Gal 可以除去 SupraNO 的半乳糖，产生 NO 供体后释放两个 NO分子。

将水凝胶作为 NO 仓库注射到肿瘤内后，肿瘤环境中的 β-Gal 会持续触发 NO 的释放，并以低剂量提供 NO 的局部持续递送；在辐射前注射大量 β-Gal 可以控制释放大量的 NO。

酶促控制释放 SupraNO 中的 NO

▲图 2 | 酶控 SupraNO 释放 NO。A）在不添加和添加的 β-Gal （0.2 和 2.0 UL-1）的情况下，SupraNO （0.1 wt%）的 NO 释放曲线。B） 不同细胞的 β-Gal 表达水平。C）NO 成像探针处理的 B16 和 H-B16 细胞的代表性荧光显微图像。D）在常氧和缺氧条件下每组中 NO 强度的量化。(来源：Advanced Materials)

实验表明，在体外和细胞水平上，SupraNO 释放 NO 的剂量和时间均可由 β-Gal 进行调控，比市售的 NO 供体 GSNO 释放 NO 的能力更可控、更持久。

SupraNO 的细胞毒性和放疗增敏作用的体外评价

▲图 3 | 通过克隆形成实验评估的体外放射增敏效率。A) B-16 和 HB-16 细胞在 0、4、6、8 Gy 的 γ 射线照射下，在常氧环境中加或不加 SupraNO (200μм)处理 24 h 的代表性克隆图像和存活分数曲线。B)SupraNO (200μм) 乏氧处理 24h 后 B16 和 H-B16 细胞在 0、4、6、8 Gy 的 γ 射线照射下的代表性克隆图像和存活分数曲线。C-F) B16 细胞 (L-Control)、B16 细胞用 200 μм SupraNO 处理 (L-SupraNO)、H-B16 细胞 (H-Control)和 H-B16 细胞用 200μм SupraNO (H-SupraNO)处理后在 γ 射线照射下，在常氧和乏氧环境中存活分数曲线的比较。(来源：Advanced Materials)

β-Gal 酶促释放的 NO 对正常细胞无危害，而对 B16 细胞表现出明显毒性，这可能是由于 B16 细胞中 β-Gal 的过量表达。实验结果表明，乏氧条件下经 SupraNO 处理后，辐射对 DNA 的损伤可与常氧水平相当，说明 SupraNO 在高浓度 β-Gal 催化下可以使乏氧癌细胞恢复在常氧下对放射治疗的敏感水平。

SupraNO 仓库的体内抗癌作用和放射增敏作用

▲图 4 | SupraNO 仓库的抗肿瘤和放射增敏活性。A)SupraNO 在小鼠模型中的放射治疗致敏示意图。B) 平均和 C) 不同组中的个体肿瘤生长动力学。D) 各组 DAPI 和 TUNEL 染色的肿瘤组织切片的代表性图像。IR(-)：无辐照。IR(+)：辐照。E)不同组小鼠的平均体重。（来源：Advanced Materials）

实验发现小鼠体内注射后 48h 仍然能检测到 SupraNO，这说明 SupraNO 水凝胶可作为 NO 仓库用于 NO 的持续释放。在小鼠 B16 荷瘤模型上，LH-SupraNO+IR 组接受了 SupraNO 注射和放疗前的 β-Gal 注射，以达到持续低剂量释放 NO 和放疗前高剂量 NO 释放的效果。结果表明，该组与其他组相比显示出最优的抗肿瘤作用。

SupraNO 仓库使肿瘤血管正常化

▲图 5 | SupraNO 仓库的血管正常化能力。A）不同组肿瘤组织切片的代表性免疫荧光图像。细胞核用 DAPI（蓝色）染色。CD31+ 内皮细胞被染成绿色 NG2+ 周细胞被染成红色。B) 量化每组中 CD31+ 面积百分比、NG2+ 面积百分比和周细胞覆盖率 （NG2+/CD31+）。（来源：Advanced Materials）

在肿瘤微环境中，低剂量的 NO 可以重塑肿瘤血管和免疫微环境。实验结果可得，LH-SupraNO 结合放疗组相比其他组，血管密度和肿瘤灌注通量明显增加。低剂量 NO 和高剂量 NO 与放射对肿瘤细胞的联合作用，使肿瘤细胞分泌的引起血管异常的细胞因子大量减少。

参考资料：
1.Yang, C., Mu, G., Zhang, Y., Gao, Y., Zhang, W., Liu, J., ... & Liu, J. Supramolecular Nitric Oxide Depot for Hypoxic Tumor Vessel Normalization and Radiosensitization. Advanced Materials, 2202625.