【医药】重组蛋白药物的生产技术及其药效延长方法

重组蛋白药物是生物药物中的核心产品，主要是通过基因工程菌来生产功能蛋白或其突变体，用于弥补体内蛋白的缺失，从而对疾病的治疗发挥关键作用。近年来，重组蛋白药物在疾病治疗中发挥作用越来越大，相关技术也发展迅速。重组蛋白药物种类繁多，包括多肽药物、基因工程药物、重组蛋白疫苗、抗体类药物等。相较于传统药物，重组药物活性、特异性均更高，且毒性低，更加安全有效。目前，市场上重组蛋白药物表现为胰岛素、激素、人造血因子、尼妥珠单抗等，临床应用广泛。重组蛋白药物的整体产业链分为上、中、下游，其中上游是基于基因工程技术、细胞工程技术的研发环节，中游为药物及给药系统生产制造，包括大规模细胞培养、重组蛋白纯化与质控。

1、重组蛋白药物生产的表达系统

目前在工业应用中，涉及到多种重组表达系统，其中在生产重组蛋白药物中，主要应用大肠杆菌、酵母和哺乳动物 CHO 细胞系 3 种表达系统。在3种表达系统中，大肠杆菌系统最为简单。此系统涵盖多种类型的菌株，这些菌株的主要差异在于筛选标记、诱导方式、有无信号序列、营养缺陷型及特殊蛋白质折叠机制。对于大肠杆菌的基因工程改造更好地完善了大肠杆菌表达系统，如编码二硫键异构酶的基因已稳定整合到大肠杆菌的基因组中，确保蛋白正确折叠，提高胞内蛋白的折叠和溶解性。重组蛋白在大肠杆菌周质空间中的有效分泌可提高大肠杆菌表达的蛋白可溶性。大肠杆菌表达系统主要用于多肽类药物的生产，如重组人胰岛素和重组甲状旁腺激素等。

酵母系统主要包括酿酒酵母和毕赤酵母，此外还包括一些非传统的酵母种类，如汉森菌多形酵母、脂酵母、裂殖酵母和乳酸克鲁维酵母菌也已发展为合成各种不同特性蛋白药物的宿主。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是广泛研究的酵母表达系统之一，用于生物制药合成的宿主。糖基化是重要的翻译后修饰之一，尽管酵母可以进行N?糖基化和O?糖基化，但与人源细胞的糖基化模式有显著差异，其分泌的重组蛋白会形成α?1，3?甘露糖化，导致蛋白免疫原性增加、半衰期缩短。通过在酵母中准确引入人源糖基转移酶和糖苷酶，删除超甘露糖化基因，可以使酵母糖基化途径与人糖基化途径相似，从而保证治疗蛋白的药代动力学特性。毕赤酵母（Pichia pastoris）生长快，发酵细胞浓度高，可产生大量重组人源蛋白。毕赤酵母系统能够灵活地选择合适的载体和兼容宿主，高效、经济地表达重组蛋白，保证产品成功开发。

CHO 细胞系是一种来源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系，能够产生人同源性蛋白。人体组织纤溶酶原激活剂是1986 年第一个在 CHO 细胞系中成功生产并批准临床使用的重组治疗蛋白。随后，越来越多的治疗性蛋白质在哺乳动物细胞中被制造出来，并且随着工艺的优化，在该表达系统中生产重组蛋白的技术得到了迅速发展。

在广泛筛选表达系统时，蛋白的高表达量、翻译后修饰质量和遗传稳定性是主要的标准。不同的表达系统具有各自的优缺点，需要根据产品的特性选择合适的系统和宿主。优势宿主的筛选是生产异源蛋白的关键步骤。在选择优势宿主时，通常采用高通量筛选技术，这种技术的出现彻底改变了宿主筛选技术领域，通过使用 96 深孔板或类似技术对多个批次实验进行平行筛选，提高了宿主的筛选效率。最终选择的宿主要在产品质量、滴度、特定生产率、工艺可行性、预期的电荷变体和糖基化配置、没有或较少的聚集形成和克隆稳定性上满足标准。

2、细胞培养

在选择好最佳宿主后，下一个重要环节是细胞培养的开发。为了更好的控制和优化细胞培养过程，开发了各种新的技术和工具。通常，在宿主发酵生产蛋白药物时，通过优化培养基、温度、pH、接种量和生产动力学等参数来提高蛋白质的合成。生物量增长率是促进产品合成的关键因素，对于补料分批生产技术至关重要，某些医药公司将宿主细胞增长率保持在小于最大增长率的特定值，通过补料来控制宿主细胞以特定增长率生长。不过，近年来制药行业越来越关注通过将分批生产转变到连续生产来提高生物合成效率。

在发酵工具上，使用自动化控制的一次性生物反应器系统是当今生物制药公司的一个新趋势。与传统的不锈钢系统相比，一次性系统投资成本和操作成本更低，生产周期更短，灵活性更好，大大减少了污染的几率。这些一次性生物反应器及其附件可从50L扩大到2000 L的规模。从细胞工程到细胞培养方法的创新开发，使得单克隆抗体的产量从50 mg·L-1提高到5~20 g·L-1。

3、重组蛋白药物分离纯化

通过优化好的细胞上游培养工艺，特定的表达系统会产生大量的重组药物蛋白，其中还包含一些宿主本身的蛋白、核酸等杂质，这些杂质可能对人体产生不利的生物活性。因此，对药品的纯度要求非常严格，这就需要对产品蛋白进行精度纯化。此环节是重组药物蛋白制备技术的关键，是决定蛋白药物品质的核心。单克隆抗体或任何其他蛋白（包括重组酶）一般是通过各种过滤步骤和色谱层析等技术进行纯化的。色谱法是纯化有价值产品最合适的技术，许多成熟的色谱方法已经应用到实际的生物制药生产中。

细胞培养完成后，离心、大孔径切向流过滤和深度过滤是用于初级细胞澄清的常用技术，深度过滤和生物减重过滤器有助于二次澄清过程。不同的表达系统可能会有不同的分泌部位，导致收集方式不同。如在大肠杆菌中表达的重组蛋白通常以包涵体的形式积累，需要回收后在体外重新折叠这些蛋白质，使其具有生物活性。

由于蛋白药物混合物中含有大量不同化学性质的杂质，单一的色谱技术往往不足以获得良好的分离。传统的重组蛋白药物纯化工艺，是在收获澄清后进行超滤浓缩，随后进行逐级的单柱色谱分离纯化，在充分了解目标蛋白和杂质的理化性质后，尽量减少纯化步骤，一般分离纯化不超过4步。随着技术的发展，一种创新的固定相被开发出来，其结合了两种分离机制（反相或HILIC和离子交换），形成一种混合模式的纯化方式。考虑到蛋白药物混合物通常需要结合基于多种不同分离原理的色谱技术来提高分辨率，从而产生多维色谱分离技术。在线多维色谱中，从第一根色谱柱流出的产物会立即注入第二根色谱柱，并加快分析时间。通常，在分离过程中，质谱与多维色谱联用可提高纯度。

近年来，为了处理复杂生物分子混合物的纯化，又开发了一种称为多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）技术。MCSGP技术的原理是流动相相对于固定相逆流运动，通过一系列切换阀进行模拟，使整个过程实现循环和自动化。使用MCSGP 技术可以使目标蛋白和杂质之间的重叠峰在内部循环，以便再加工，并且可以使用溶剂梯度进行洗脱。这种技术已被用于多个需要加强纯化的案例中，如单克隆抗体、寡核苷酸、大 麻二酚和多肽的纯化。

4、重组蛋白药物的药效延长方法

重组蛋白药物相较于一般药物具有特殊性，目前，提高重组蛋白药物效果的研究方法主要基于如下3 种原理产生，第一，提高药物蛋白分子量，降低肾小球过滤；第二，借助游离型或者结合型药物，维持血浆平衡，减缓药物释放；第三，降低异源蛋白免疫原，以有效降低药物释放率。基于以上3 种原理出现了以下延长药效的方法。

①构建突变体：采用构建突变体延长药物半衰期的方法主要如下：第一，提升药物糖基化度，以此增加药物表面侧链，提升蛋白质平稳度，防止蛋白酶快速降解药物；第二，提高药物分子量，避免肾小球过滤，延长游离型药物作用时间。基于上述两种方法目前存在下述研究：第一，重组人促红细胞生成素（EPO）存在1个O与3个N 糖基化位点。O是否糖基化与人体活性关系以及清除速度关系不大，但是N如果不完全重组则会影响人体活性，会导致体内活性降低。即是说，N 糖基化更为重要，它能够维持活性同时降低清除率。第二，研究基于大肠杆菌的K12株发现，基于人胰岛素A-21位点下的反应Asp 变为了Gly，在B-30位点下的反应使得 PI-pH4.0变为了pH6.7。该突变能够形成澄清溶液，进入人体后鉴于其电解特点，可以转化成难溶物质，并持续释放，溶于血液，长时间保持平稳，没有尖峰，由原来的4-8h药效延长至24h以上，由每日3次的给药变为每日1次。

②PEG 化修饰：聚乙二醇共价修饰蛋白质即为 PEG 化修饰。采取提升蛋白质分子量的方式降低药效流失，将 PEG 作为屏障隔离蛋白质分子表面反应，降低免疫原性，降低药物流失速度，同时保护蛋白质不被水解。PEG 的上述作用可以大大提升药物抗衰期时间。目前，存在两代 PEG 修饰法，一是借助分子量不足 12kDa 的分子；二是借助分支PEG 替代 PEG，提升偶联分子量，同时增加其数量，使其达到 60kDa。相较于一代，二代方法还能够避免蛋白质被酶水解，同时屏蔽效应更大，同时降低清除率，是延长药效的有效方法。

③血清白蛋白融合：人体中的血清白蛋白，简称 HSA，其内含 585 氨基酸球形蛋白质，分子量为 65kDa，属于人体中高血浆含量蛋白质。HSA 是诸多内外源物质载体，药物与 HSA 结合后，能够降低生物利用度，并在同一时间增加半衰期。临床诸多治疗蛋白药物以及多肽药效均较短，但是 HSA 理论上最长能够将其提升到 19d，同时由于 HSA 基因还能够高效表达，杂质少，因此属于延长药效的重要方法。

目前，大量用于治疗多种人类疾病的重组蛋白药物，已获批准并上市。经过几十年的技术发展，我国重组蛋白药物也取得了很大的进步，尤其是近两年新冠疫 苗的研发上。随着分子和细胞技术的不断发展，重组蛋白药物的产量和质量也有了很大的提高，加工周期大幅缩短。随着基因编辑技术的发展，特别是 CRISPR/Cas9 等新型技术的应用，载体工程取得新的突破，未来越来越多特定改造的细胞系将被用于重组蛋白药物的生产。此外，进一步提高国内重组蛋白药物的长效性，推动相关标准的升级和创新，促进长效性蛋白药物的开发，也是我国生物医药的研究重点。

参考资料

[1]周娜娜,王小艳,张媛,王靖,赵国淼,魏超,杨凯,安泰.重组蛋白药物的生产技术进展[J].生物技术进展,2021,11(06):724-731.DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0130.

[2]李学琴. 长效重组蛋白药物的研究进展[J]. 健康之友,2020(14):291,290.

作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。