端粒复制子的体外重组揭示干预癌症的潜在靶标

撰文 | Qi

端粒存在于线性染色体末端，包含重复序列DNA和相关蛋白质，端粒的复制允许人类干细胞的持续增殖和癌细胞永生。端粒酶使用其RNA模板和逆转录酶催化亚基来延伸端粒G链 (TTAGGG)n，而互补的C链 (CCCTAA)n的合成较少被表征。CST（CTC1–STN1–TEN1）异源三聚体蛋白复合物作为一种DNA聚合酶α-引物酶辅助因子，能够结合ssDNA，对富含G的序列具有一定的特异性，这使其在端粒保护和复制中发挥特殊作用（Nature | 何垚/宋贺等解析端粒DNA延长关键复合物的冷冻电镜结构）。在端粒酶在染色体末端延伸G链尾部后，Polα-primase使用该G链DNA作为模板进行互补C链合成。在酵母中鉴定出CST复合物之前，其单个亚基已被证明是端粒维持所必需的【1, 2】，随后CST对端粒复制的重要性逐渐扩展到植物和哺乳动物中【3, 4】，这些研究为体外重组研究奠定了重要基础。

2022年7月13日，来自美国科罗拉多大学波尔德分校的Thomas R. Cech团队在Nature杂志上发表了一篇题为Reconstitution of a telomeric replicon organized by CST的文章，他们发现CST复合物不仅终止端粒酶延伸【5】，将Polα-primase募集到端粒 ssDNA【1, 2】，还能协调端粒C链合成。由于端粒复制具有不同于基因组其余部分复制的特征，因此靶向包括CST在内的端粒复制组分有望用于癌症治疗。

研究人员首先在HEK293T细胞中表达重组人CST，纯化出的CST还携带内源性Polα-primase的四个亚基。为了测试CST-Polα-primase活性，作者制备了对应于端粒酶延伸产物的ssDNA模板并共孵育。其中，以9×TEL（代表TTAGGG的9重复）为模板的最显著产物始于从3′ 末端开始的第三个端粒重复。天然端粒ssDNA将与蛋白异二聚体POT1-TPP1结合【6】，于是作者在与POT1-TPP1N结合的各种端粒DNA模板上测试了C链合成。在与模板等摩尔浓度下，POT1-TPP1N对C链合成没有影响，但10倍过量的POT1-TPP1N能覆盖模板导致C链合成的显著抑制。

如果端粒重复定义复制起始位点，那么C链合成应该需要CST的DNA结合活性。于是作者利用CST的CTC1亚基的两个DNA结合突变体（不影响与Polα-primase的结合）测试这一假设。两个突变体对N×TEL DNA的亲和力以及C链合成活性均显著降低（图2），提示CST的DNA结合对于CST-Polα-primase的作用非常重要。这一验证基于3个以上的TEL重复，那么少于3个重复能否作为复制起点呢？作者发现，2×TEL能达到与3×TEL一样的效果，但1×TEL 作为起点则完全不活跃。这些发现确认了对于复制起始的最低要求。接下来，作者通过四个实验证明C链起始于RNA引物，证据主要包括以[γ-32P]ATP作为唯一标签的产物与用[α-32P]dCTP标记的产物类似，以及RNA水解处理后产物ladder向下移动了约8 nt，提示RNA引物的大致长度等。

体内复制端粒的困难部分归因于GQ（即G-四链体，富含G重复的DNA折叠形成的高级结构）结构的形成。作者想知道破坏GQ是否会影响C链合成，于是在保留了3×TEL作为复制起点后，将剩余的TEL重复从TTAGGG突变为TGAGTG，断开连续的G则阻止了GQ形成。作者发现，破坏GQ后显著增加了9×TEL和15×TEL模板的C链合成。此外，由于GQ折叠由K+高度稳定，对Na+稳定性较差，且不能被Li+稳定，因此，作者观察到如果用Li+代替K+同样来阻止GQ形成，也能极大地改善C链合成。

需要注意的是，癌细胞永生需要端粒维持，端粒末端复制成分可能代表对肿瘤细胞比正常细胞具有特异性的靶标，与此一致，CST组分的三个基因在CRISPR-Cas9筛选对短端粒的癌细胞系生长很重要的基因中排名最高。因此，结合这项工作，CTC1亚基的ssDNA结合位点或所有3个CST亚基中的Polα-引物酶结合位点似乎可以成为干扰端粒末端复制非常有前景的靶标。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04930-8

制版人：十一

参考文献

1. Qi, H. & Zakian, V. A. The Saccharomyces telomere-binding protein Cdc13p interacts with both the catalytic subunit of DNA polymerase α and the telomerase-associated Est1 protein.Genes Dev.14, 1777–1788 (2000).

2. Grossi, S., Puglisi, A., Dmitriev, P. V., Lopes, M. & Shore, D. Pol12, the B subunit of DNA polymerase α, functions in both telomere capping and length regulation.Genes Dev.18, 992–1006 (2004).

3. Surovtseva, Y. V. et al. Conserved telomere maintenance component 1 interacts with STN1 and maintains chromosome ends in higher eukaryotes.Mol. Cell36, 207–218 (2009).

4. Miyake, Y. et al. RPA-like mammalian Ctc1–Stn1–Ten1 complex binds to single-stranded DNA and protects telomeres independently of the Pot1 pathway.Mol. Cell36, 193–206 (2009).

5. Chen, L. Y., Redon, S. & Lingner, J. The human CST complex is a terminator of telomerase activity.Nature488, 540–544 (2012).

6. Lim, C. J. & Cech, T. R. Shaping human telomeres: from shelterin and CST complexes to telomeric chromatin organization.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 22, 283–298 (2021)

转载须知

【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。