从非生殖细胞中创造，清华丁胜教授团队开发化学诱导全能干细胞

在哺乳动物中，固有全能性是指细胞在胚胎和胚外组织中产生所有分化细胞并形成生物体的能力。在小鼠中，只有合子及其直接后代2细胞期卵裂球具有全能性。随着胚胎的进一步发育，全能干细胞进行不可逆分化，全能性会逐渐丧失，转为多能干细胞，然后成长为行使不同功能的成熟体细胞，再经历增殖、衰老、凋亡的程序化命运。如何打破细胞命运程序，让细胞实现“返老还童”是科学家们孜孜不倦探索的课题。

2006年，日本京都大学教授山中伸弥（Shinya Yamanaka）等人在Cell杂志上报道通过转染四种转录因子（Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc）将小鼠成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，在全球掀起了诱导多能干细胞的研究热潮。

然而多能干细胞（PSCs）的发育潜力相较于全能干细胞（TotiSCs）是有限的，无法发育成完整的个体，如何从非生殖细胞体外诱导、捕获和长期维持全能干细胞状态是生命科学领域亟待突破的问题。

2022年6月21日，全球顶级科学期刊Nature提前在线发布了一篇题为“Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail”的研究论文。

注：Accelerated Article Preview（AAP）为Nature杂志的提前在线发布形式之一，是对期刊编辑、同行科学家认为的具有重大科学意义研究成果的加速报道。

清华大学药学院院长丁胜教授及其团队在这项研究中首次发现了能在非生殖细胞中诱导和长期维持全能干细胞的药物组合——TTNPB、1-Azakenpaulone和WS6（缩写为TAW）。通过这个药物组合诱导成的全能干细胞在转录组、表观基因组和代谢组水平上与小鼠全能2C胚胎期细胞高度相似，并且具有双向发育潜力，能够在体外和畸胎瘤中产生胚胎和胚外细胞。该研究证明了从非生殖细胞体外产生全能干细胞的可行性，并提供了一个细胞系统，以更好地操纵和理解细胞的全能状态，从而从非生殖细胞中创造生命。

研究过程

PROCESS

图片

01

化学筛选：确定能够从mESCS中诱导TotiSCs的化合物

MERVL-tdTomato报告基因是一种全能性标志物。将经过MERVL-tdTomato报告质粒转染的R1-mESCs用胰蛋白酶处理，然后在含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的384孔培养板上，以每孔800个细胞，40微升mESC培养基培养。铺板 8 小时后，通过 Echo550 用 Sigma-LOPAC 和 Selleck-FDA 批准的药物库中的每种化合物处理细胞，浓度为 5 µM。同时，DMSO用作阴性对照。处理 72 小时后，通过共焦 Opera phoenix 对板进行成像，并通过 HARMONY 分析系统和 PhenoLOGIC 机器学习算法 (PerkinElmer) 进行分析。选择可以使tdTomato阳性细胞比对照组增加3倍以上的化合物作为候选苗头化合物。

丁胜教授及其团队从3000多种化合物中筛选出了23种可以使tdTomato阳性细胞比对照组增加3倍以上的化合物，并在这些苗头化合物中发现了几种RAR激动剂。通过在含有RAR激动剂的环境下长期培养这些tdTomato阳性细胞，发现单独激活RAR不足以建立和维持细胞全能性，随后以组合的方式检测了其他一些会增强干细胞重编程、存活或自我更新的小分子。

设计并构建一个包含两个子组的14种化合物库。第1组包含第一轮化学筛选的7种苗头化合物，第2组包含据报道可增强细胞存活、增殖、重编程和分化抑制的化合物，如下图。

在测试了这些化合物组合后，确定了其中11种组合可在体外实现MERVL-tdTomato阳性细胞的诱导和长期维持。对这11种组合进行RNA-seq分析发现由TTNPB、1-Azakenpaulone和WS6（缩写为TAW）相关结果表明，TAW能够从小鼠胚胎干细胞中产生化学诱导的全能干细胞（ciTotiSCs），并允许在体外维持正常二倍体核型的多次传代。

02

分子特征分析：鉴定ciTotiSCs全能性

为了鉴定上述结果，丁胜教授及其团队严格分析了ciTotiSCs的整个转录组，通过scRNA-seq在单细胞水平上评估ciTotiSCs的细胞异质性，使用转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq；相关研究试剂由近岸蛋白Novoprotein提供，目录号：N248）来研究ciTotiSCs中全基因组染色质可及性，进行简化甲基化测序（RRBS），并进行代谢组学分析。结果显示：ciTotiSCs在体外生成的胚胎在转录组、表观基因组和代谢组水平上与小鼠早期全能胚胎高度相似。

03

小鼠嵌合实验：验证ciTotiSCs分化潜能

为了验证ciTotiSCs的分化潜能，研究组先比较了mESCs和ciTotiSCs在体外分化的情况，随后又使用ciTotiSCs进行小鼠嵌合实验。

在微量注射之前，将tdTomato标记的mESCs和tdTomato标记的ciTotiSCs用0.05% 胰蛋白酶-EDTA处理消化成单细胞，并在0.3%明胶上铺板30分钟以去除饲养层。将tdTomato标记的mESC和 tdTomato标记的ciTotiSC的单个或4-8个细胞注射到ICR小鼠8细胞期胚胎中，并在KSOM培养基中培养48小时生成嵌合E4.5胚泡。然后，对嵌合胚胎进行成像和固定以进行免疫染色。将4-8 个细胞注射到ICR小鼠8细胞期胚胎中以生成嵌合 E7.5/E12.5 胚胎，并在 KSOM 培养基中恢复1-2小时。然后将注射的胚胎移植到性交后0.5或2.5天的假孕雌性ICR小鼠的子宫角中。将E7.5嵌合体胎体解剖并固定用于免疫染色。对E13.5嵌合体胎体进行解剖、成像和进一步分析。将E13.5嵌合体的胎盘分离、固定并切片用于免疫组织化学。

结果发现：ciTotiSCs不仅能够在体外和畸胎瘤中自发分化为胚胎和胚外谱系，还能在生物体的胚胎和胚外组织中生成所有分化的细胞类型，功能类似全能卵裂球。

总结

SUMMARY

图片

这项研究证明了从非生殖细胞中体外产生小鼠全能干细胞的可行性，并提供了一个稳定的系统以便科学家们更好地操纵和理解全能干细胞，探索有关生命起源的基本问题。

从这个意义上来说，这篇论文迈出了探索生命起源的重要一步，为后续研究开辟了巨大的机遇。同时也为再次创造个体生命，甚至是加速物种进化创造了可能。

参考文献：Hu, Y., Yang, Y., Tan, P. et al. Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail. Nature (2022). 10.1038/s41586-022-04967-9

文中转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）相关研究试剂(目录号: N248）来自近岸蛋白Novoprotein。

体验ATAC-seq实验，惊喜优惠券申领进行时！

欢迎扫码申请ATAC-seq相关研究试剂优惠券

图片

活动时间：即日起~2022年7月31日
活动规则：
1. 本活动仅限终端用户参与；
2. 请填写真实有效的信息，信息经近岸蛋白审核后，即可获得100元优惠抵扣券；
3. 优惠券仅限购买ATAC-seq相关试剂使用；
4. 优惠券申领时间截止2022年7月31日，使用时间截止2022年8月31日；
5. 本活动的最终解释权归苏州近岸蛋白质科技股份有限公司所有。

Company introduction

知了窝是国内领先的生命科学大数据服务提供商，致力于通过大数据和人工智能技术帮助科研人员快速找到科研产品，减少科研浪费，提高科研效率，更快更好地取得突破性发现；帮助生命科学技术企业沉淀产品信息，铸就品牌价值，构建科研人员与科研企业之间的信任通道。

图片