如何表征水凝胶的抗菌性能？有哪些检测手段？

抗菌性水凝胶具有抑制细菌生长的能力，其在伤口护理等领域有较高的应用价值。在相关课题研究中，一般研究者选择金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）等细菌模型来探究水凝胶的抗菌效果，那么具体的检测方法有哪些呢？本期EFL将为大家解读几种常见的水凝胶抗菌检测手段，并通过案例分析具体的检测方法及结果。

01

OD值计数法

Step1：将一定菌液浓度（约106 CFU/ml）的细菌悬液与抗菌凝胶孵育12h后（时间不定，可根试验设计调整抑菌时间）；

Step1：孵育结束后将细菌悬液（稀释适当比例，便于后期计数），采用OD值计数法计算抑菌率。

OD值计数法免去涂板操作，可直接对抗菌凝胶作用后的细菌悬液进行OD600吸光度值的测定，OD值越低，抗菌作用越强。

02

涂布平板法

Step1：将一定菌液浓度（约106 CFU/ml）的细菌悬液与抗菌凝胶孵育12h后（时间不定，可根试验设计调整抑菌时间）；

Step2：，孵育结束后将细菌悬液（稀释适当比例，便于后期计数）接种至固体营养培养基表面，37℃培养12-24h后，取出培养皿拍照计数，可分别采用平板计数法和活死/染色法，计算抑菌率。

平板计数法可通过明场拍照，利用ImageJ软件计算得到抑菌率；

活死/染色法可利用活死细菌双染试剂盒分别将活细菌和死细菌染上绿色和红色后，进行细菌活死的镜检观察，该方法更为直观。

03

抑菌环法

Step1：将一定体积大小的圆柱形水凝胶样品或浸润抗菌凝胶溶液的纸片放入均匀涂有细菌悬液的固体营养培养基上;

Step2：37℃培养12-24h后，最后测量抑菌环大小。

水凝胶的抗菌性能即可由抑菌环的直径来决定，直径越大则抗菌性能越好，反之则抗菌性能越差。

04

扫描电镜法（SEM）

Step1：将水凝胶作用后的细菌经2.5%戊二醛溶液于4℃条件下固定40分钟，

Step2：依次使用浓度为20-100%的乙醇水溶液进行梯度脱水后，干燥后进行SEM观察。

通过SEM图可直观看出：空白试样组处理过的细菌细胞膜是完整光滑的，而抗菌水凝胶处理后的细菌细胞膜一般会发生皱缩，发生形变甚至破裂。

案例一

Advanced Science（IF=16.806）纳米多巴胺水凝胶提高光热转换率用以抗菌及伤口愈合 2022.02.22

简介：该研究将Ag包裹PDA纳米颗粒（PDA@Ag）载入阳离子瓜尔胶水凝胶中，利用光热效应实现抗菌。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202106015

图1 CG/PDA@Ag (CPA2)水凝胶的抗菌性能

检测手段：

涂布平板法、扫描电镜法（SEM）

检测结果：

（1）研究者以S. aureus和E. coli为细菌模型，利用测试近红外光响应性抗菌凝胶的抑菌效果，明场图及CLSM荧光图表明负载PDA@Ag纳米粒子的瓜尔胶水凝胶（CPA2）在近红外光（NIR）作用下，能显著增强凝胶的抗菌作用，单一负载PDA的水凝胶的光热性能较弱，不足以杀死细菌。且荧光检测结果与平板计数法结果具有相同的抗菌趋势；

（2）通过SEM观察各组凝胶作用处理后的细菌图可知，在近红外作用下，CPA2水凝胶对细菌细胞膜的损伤更为严重，导致细菌扭曲甚至破裂。结果表明，CPA2 + NIR抗菌平台具有显著的杀菌作用，可诱导细菌细胞膜的破坏。

案例二

ACS Applied Materials & Interfaces（IF=9.229）具有广泛耐温性、粘附性和内在抗菌特性的新型糖尿病足伤口敷料水凝胶2021.06.07

简介：该研究将ε-聚赖氨酸（ε-PL）载入聚丙烯酰胺与明胶的复合水凝胶中，利用抗菌多肽-聚赖氨酸的抗菌作用实现抗菌。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202106015

图2 双网络G-PAGL水凝胶的抗菌性能表征

检测手段：

抑菌环法、OD值计数法、扫描电镜法（SEM）

检测结果：

（1）研究者以S. aureus和E. coli为细菌模型，抑菌环法显示，随着G-PAGL凝胶中聚赖氨酸成分的增加，抑菌圈逐渐增大，表明其抗菌作用主要归因于ε-PL的含量。

（2）OD值计数法显示，对比空白组，随着孵育时间的延长，实验组OD值逐渐下降，表明G-PAGL的持续抗菌性能。

（3）通过SEM观察各组凝胶作用处理后的细菌图可知，细菌接触G-PAGL水凝胶后，表面粗糙，发生形变，表明细菌死亡。也证实了G-PAGL水凝胶是通过破坏细胞膜来杀灭细菌的。这一机理可以解释为水凝胶的正电荷通过干扰表面ζ电位而破坏细菌膜。

表1 四种抗菌检测手段的优缺点对比

小贴士：

通过对以上四种常见水凝胶抗菌检测手段及案例分析的学习，研究者可从多方面综合分析课题设计中抗菌水凝胶的抑菌效果。其中，相较于其他检测手段，涂布平板法中细菌活死双染法可直接对抗菌凝胶作用后的细菌进行着色观察，得到数据图更为直观。研究者通常选择SYTO 9/PI 活死细菌染料来鉴别细菌的生长状况。