单细胞分辨率、全基因组水平——幽门螺杆菌精准诊疗新突破

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　　作者：Lily

　　导读：幽门螺杆菌（H.pylori）是一类致癌原，同时也是胃癌发病的主要元凶之一。其菌株耐药性严重、生长缓慢且需要严苛的培养环境，因而增大了H.pylori临床药敏诊断及溯源的难度，对胃部炎症、胃癌等疾病的预防及治疗极为不利。近日，青岛生物能源与过程研究所等机构组成的研究团队研发了CAST-R-HP诊疗技术，以单细胞分辨率、全基因组水平实现H.pylori耐药机制研究与精准溯源，在基因组水平上绘制幽门螺杆菌异质性。

　　幽门螺杆菌药敏检测瓶颈

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　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称H.pylori）是目前所知的唯一能在人体胃中生存的微生物，可引起人类胃炎、消化性溃疡及胃癌发病。全球约有50%的人口感染H.pylori，70%以上的胃癌病例被发现与感染H. pylori有关。在我国，H. pylori的感染率高达60-70%；在慢性胃炎患者活检标本中，H. pylori检出率高达80-95%。早在1994年，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）就将H.pylori列入一类致癌原清单。目前业界公认，H.pylori感染是预防胃癌最重要的可控危险因素。因此，快速识别H.pylori感染并选择敏感抗生素正确组合对于预防或治疗胃癌等胃部疾病至关重要。

　　然而，H.pylori菌株耐药严重，生长缓慢且难以培养——H.pylori对生长环境条件的要求十分苛刻（厌氧、酸性环境）。这些因素导致了H.pylori的高耐药率、低根除率和高疾病负担。目前，急需建立一个高效的H.pylori药敏诊断、治疗与溯源体系，以增强临床治疗效果、及早进行胃癌防控。

　　当前，内镜检查与细菌培养相结合的药敏检验方式是H. pylori耐药菌鉴定的临床黄金标准，但由于H.pylori生长条件苛刻，分离和培养胃活检标本中的H. pylori通常需7~10天，并难以对临床样品中的“原位”的病原多样性进行考察。而基于基因型的药敏检测方法仅能预测部分已知耐药基因的突变，并存在不同程度的假阴性。目前临床医生主要依赖经验用药而非药敏结果指导性下的精准治疗。更糟糕的是，随着H. pylori耐药性的不断增加，经验治疗的根除失败率日益增加。

　　CAST-R-HP——单细胞分辨率、全基因组水平进行耐药机制研究与精准溯源

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　　近日，针对上述H.pylori药敏检测瓶颈，来自中国科学院青岛生物能源与过程研究所（QIBEBT）的研究团队成功研发了新一代H. pylori诊疗技术——单个细菌细胞精度、“鉴定-药敏-溯源”全流程一体化的H. pylori诊疗技术（Clinical Antimicrobial Susceptibility Test Ramanometry for Helicobacter pylori ,简称CAST-R-HP）。CAST-R-HP技术可将从临床样品到药敏结果的完整流程缩短至3天，并能在单细胞分辨率、全基因组水平完成耐药机制研究与精准溯源，实现了在基因组水平上绘制幽门螺杆菌异质性的突破。其研究论文于6月18日发表于美国临床化学协会《临床化学》（Clinical Chemistry）期刊。中国疾控中心传染病预防控制所国家重点实验室、青岛市立医院的研究者也参与了此项研究。

　　https://academic.oup.com/clinchem/advance-article-abstract/doi/10.1093/clinchem/hvac082/6609555?redirectedFrom=fulltext&login=false

　　首先，研究者构建了15种临床常见胃部共生菌的单细胞拉曼光谱（SCRS）参考数据库，利用端到端的深度卷积神经网络（DCNN）将拉曼光谱特征提取与分类模型训练过程相融合，进而有效提升了基于SCRS的病原鉴定准确率——直接从临床胃黏膜样品出发，对H. pylori细胞进行识别和鉴定，准确率达98.5 ± 0.27%。

　　进而，研究者建立了单细胞精度测定代谢抑制程度的H. pylori药敏表型快检技术，并取得了良好效果——与临床标准E-test法相比，17株H. pylori临床分离株对左氧氟沙星、克拉霉素的药敏检测准确率分别为94%和100%。

　　最后，针对耐药机制研究和全基因组溯源，研究者从临床样品中直接识别特定药敏表型的H. pylori细胞，通过拉曼光镊液滴单细胞分选（RAGE）芯片，完成高均衡性的目标单细胞分选和核酸扩增。经拉曼分选后的单个H. pylori细胞，其全基因组覆盖度高达99.7%，不仅通过基因型阐明了药敏表型，还揭示了潜在的分子机制。

　　正如其研究论文总结部分（Conclusion）所描述的那样，“CAST-R-HP具有非依赖于H. pylori培养、更短的检测周转时长、高分辨率、全面的信息输出特点，是诊断和治疗幽门螺杆菌感染的强大工具。”

　　接下来，研究团队将继续探索升级CAST-R-HP技术，例如，开发基于微流体的芯片（microfluidics-based chip），进而对直接从H. pylori活检组织中提取的微量细胞进行增生（enrich）。此微流体芯片的开发运用可以进一步将基于代谢抑制的抗菌药敏试验（the metabolic-inhibition-based antimicrobial susceptibility test）的周转时长从3天减少至不到24小时。此外，研究者还表示，下一步也将会对用于治疗H. pylori感染的所有一线和二线抗生素的工作流程效用进行全面的评估。

　　该研究的资深作者、中国疾控中心传染病所单细胞中心徐健研究员表示，“CAST-R-HP技术能对H. pylori细胞进行鉴定、药敏测试、以单细胞精度对H. pylori进行基于全基因组的溯源，因此CAST-R-HP技术不仅能促进H. pylori感染的抗生素用药的精确性，还能降低一般人群的耐药性风险。”

　　技术小贴士

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　　单细胞拉曼光谱——可以快速无损地检测微生物细胞内的特征化学组分。典型的单个微生物细胞的拉曼光谱包含核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质和色素等信息。这些信息能够表征微生物细胞的基因型、表型和生理状态。因此，单细胞拉曼显微光谱是一种可用于区分微生物样品的“全生物指纹”技术，可用于研究单个微生物细胞生命阶段的转变、鉴定微生物单细胞中的色素及其他化合物的含量变化等。

　　卷积神经网络（Convolutional Neural Networks, CNN）——是一类包含卷积计算且具有深度结构的前馈神经网络（Feedforward Neural Networks），是深度学习（deep learning）的代表算法之一。

　　微流体芯片技术——将生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。以被应用于诸多分析领域，例如核酸分离和定量、DNA测序、基因突变和基因差异表达分析、蛋白质的筛分、药物研究等。

　　参考资料：

　　http://www.qibebt.cas.cn/news/zyxw/202206/t20220620_6463221.html

　　https://phys.org/news/2022-06-team-powerful-tool-aid-cancer-causing.html

　　https://academic.oup.com/clinchem/advance-article-abstract/doi/10.1093/clinchem/hvac082/6609555?redirectedFrom=fulltext&login=false

　　注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。