TaqMan—分子诊断的“八倍镜”！

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提到实时荧光定量PCR（简称qPCR），想必大家都很熟悉，它是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质，利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用荧光化学物质的不同，qPCR可分为荧光染料法（SYBR Green Ⅰ法为代表）和荧光探针法（TaqMan法为代表）。

SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用简便，价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性，即染料可以与任何dsDNA结合。因此，qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性，而TaqMan探针法的出现解决了染料法非特异性的问题。

TaqMan®检测作为荧光定量PCR金标准长久以来被广泛应用。与染料法实时PCR不同，TaqMan®检测中会增加荧光探针成分，探针通过荧光共振能量转移（FRET）发生作用。

在 PCR 开始之前，TaqMan® 探针完整且具有一定的灵活性。探针完整时，报告基团和淬灭剂之间具有天然的亲和力，可促进 FRET 的发生。在 PCR 开始之前，报告基团信号被淬灭。

Taqman探针法荧光定量PCR，通过在常规的PCR体系中引入一条Taqman探针来进行实时荧光检测。这条Taqman探针是一条寡核苷酸，其能够结合到PCR正反向引物结合区域的内部，随着PCR反应的进行，DNA聚合酶在延伸到探针位置会将其水解，从而产生信号。因此Taqman探针属于水解探针的重要成员之一。

Taqman探针的5端标记有荧光基团，3端标记有相应的淬灭基团。由于Taqman探针长度的限制，当探针完整的时候，荧光基团处于淬灭基团的淬灭范围内，荧光大部分被淬灭基团吸收或转换为别的波长的光，此时仪器检测不到相应的荧光值。

在PCR退火过程中，探针优先结合到待扩增区域，然后DNA聚合酶从引物位置开始延伸，一直延伸到探针位置，此时DNA聚合酶的5-3核酸外切酶能够将Taqman探针水解。水解之后，荧光基团脱离了淬灭基团的束缚，释放出强烈的荧光，从而被仪器检测到。

探针序列的设计原则

并不是任意一段序列都适合作为Taqman探针，其设计要掌握以下几个原则：

1. Tm值及长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在67-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，在退火过程中优先结合到模板上。

2. 探针的序列

● 探针序列要与模板能够完全互补配对，探针尽量避免出现二聚体或者高级结构，以保证足够高的模板结合效率。

● 探针的5端最好紧邻对应引物（结合同一模板链的那条引物）的3端，这样能够保证在PCR扩增时第一时间将探针水解释放荧光信号。

● 探针两端的各两个碱基不能为G，即使单独的G碱基也会对荧光基团产生淬灭作用，从而影响荧光或者淬灭效率。

● 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，较多的G会产生高级结构，对探针的合成以及使用产生负面效果。

Taqman探针的设计软件

关于Taqman探针的设计，小编首推ABI公司的探针设计软件Primer Express；

如果熟练掌握了上述设计原则，也可以通过其他工具，如Primer 3，Primer Premier、Oligo甚至NCBI都可以进行引物和探针的设计。优秀的探针序列是得到精准结果的前提。

荧光基团与淬灭基团的选择

Taqman探针的另一精华在于修饰基团，在选择修饰基团时，需要注意以下几点：

●根据荧光定量PCR仪选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团，如FAM（FITC）

（5-FAM和6-FAM为同分异构体，与FITC在与Oligo的连接方式上不同，但其发光基团均为荧光素，因此使用上没有区别。图片来源于网络）

●根据荧光基团的种类进行淬灭基团的搭配。早期的淬灭基团多为TAMRA或者DABYCL，但TAMRA自身也会发出荧光干扰检测，而DABYCL的淬灭范围非常有限，极大地限制了Taqman探针的使用。目前淬灭基团最常用的是Biosearch Technologies公司的黑洞系列淬灭基团（Black Hole Quencher，BHQ）。

下表为大家列出了常用荧光基团的发光信息及搭配的淬灭基团，方便大家进行选择。

使用正确的淬灭基团对于实验结果的准确性和美观性是非常重要的：

上图（来源于Sigma）显示了FAM和CY3荧光基团分别选择TAMRA、DABCYL、BHQ1、BHQ2作为淬灭基团的信噪比，从中可以看出，FAM-BHQ1和CY3-BHQ2是其中的最佳搭配。

●最常用的基团标记方式为5端荧光、3端淬灭基团。虽然早期的taqman-MGB专利（US7205105）中采用的是相反的标记方式，但目前5端荧光、3端淬灭标记属于绝对主流。

早期的MGB专利中采用了相反的标记形式。

●不建议在中间标记淬灭基团，有些客户担心探针太长，荧光基团离淬灭基团太远降低淬灭效率，但是有文献指出，这两者的距离并不是越近越好。更重要的是，3端标记淬灭基团同时起到了封闭探针3-OH的作用，使得探针无法参与扩增，这一点对于探针来说非常重要。如果一定要设计在中间，则必须在3端进行封闭修饰。

探针法的优缺点

● 特异性高

相比于染料法荧光定量PCR，Taqman法通过探针的引入，极大提升了qPCR反应的特异性。即使引物有二聚体或者非特异性条带扩增，由于没有探针的参与水解，也不会产生荧光信号，不会对定量产生影响。

● 适用于多重qPCR

探针法的另一个优点是可以做多重qPCR，能够同时检测多个指标的含量。在保证足够的扩增效率的情况下，有的研究者会将两套甚至更多引物和探针置于一个qPCR体系中，通过探针标记的荧光基团不同，分别检测相应的荧光信号变化。这样极大节省了qPCR酶的用量，降低了成本。并且某些检测，如SNP的探针法检测，是一定要使用不同的探针在统一体系下进行检测的。

● 价格昂贵

探针成本较高，有时设计的探针不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。高昂的价格是限制探针法应用的最主要因素之一。

来源：基因谷

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