人类核外泌体靶向复合物(NEXT) RNA监测的结构机理

撰文 | Enigma

RNA质量控制是保证转录完整性的关键，它依赖于辅助因子和适配体来识别和准备底物以被核糖核酸酶降解（例如3’ – 5’核糖核酸降解RNA外泌体）。人类核外泌体靶向复合物(NEXT：正确翻译应为“核外切体靶向复合物”下同) 是适配体的一种，它的功能障碍与多种疾病的发生密切相关。到目前为止，关于NEXT的结构研究仅限于单个亚基或多肽或结构域的二元复合体，并且没有完整的核外泌体适配器复合体结合到RNA的有效结构证据，这使得我们很难理解这些复合体如何识别和捕获RNA并交付到外泌体。

2022年6月9日，美国哥伦比亚大学的Christopher D. Lima课题组在Cell发表了题为Structural basis for RNA surveillance by the human nuclear exosome targeting (NEXT) complex的研究论文，他们通过解析与RNA底物结合的NEXT复合物的冷冻电镜结构，揭示了其底物识别的机制和RNA移交到外泌体之前的早期步骤。该结构中展示ZCCHC8作为一个支架，在环抱MTR4解旋酶的同时介导了NEXT的同源二聚体，并灵活地将RBM7锚定在解旋酶核心上。NEXT中的三个亚基协同结合RNA, 伴随着RBM7和ZCCHC8监测RNA底物3’端上游的序列，并促进MTR4捕获RNA。ZCCHC8的存在遮盖了MTR4的表面，而这个表面对RNA结合和挤压以及MPP6依赖的招募和对接到RNA外泌体核心都非常重要，这些相互作用通过协调RNA捕获、易位和从解旋酶到外泌体的挤压进行衰变来促进RNA监测。

RNA质量控制途径确保转录组的完整性。在真核生物中，转录组受3'到5'核糖核酸降解RNA外泌体的监视，以维持RNA的功能。此外，外泌体还负责一般的RNA周转和前体RNA的成熟。核外泌体是由9个亚基核心 (EXOSC1-9) 与分配型核糖核酸酶EXOSC10/RRP6和进程型核糖核酸酶DIS3结合而成。为了正确地靶向不同的底物，RNA外泌体需要引导并与RNA适配体复合物结合。RNA适配体复合物通常由与辅助RNA结合蛋白结合的解旋酶以及将解旋酶招募到外泌体的辅助因子（如MPP6和/或C1D）组成。在人类细胞核中，已知的适配体复合物包括核外泌体靶向复合物(NEXT)， Poly(A)外泌体靶向复合物 (PAXT) 连接，或多体保护器复合物 (PPC) 和TRF4-2-ZCCHC7-MTR4多聚腺苷化复合物 (TRAMP)。尽管NEXT和PAXT靶向相似的底物，PAXT更倾向于多聚腺苷化RNA，而NEXT通常靶向非多聚腺苷化的转录本到外泌体进行衰变。NEXT底物包括基因间位点普遍转录产生的RNA和调控元件，例如，失败和错误转录产生的转录增强子。NEXT-介导的启动子上游转录本（PROMPTs）周转确保了双向启动子的单向mRNA输出。此外，NEXT还参与了端粒酶前体RNA和microRNAs的加工和质量控制等过程。

NEXT的功能不全会对健康造成不利影响。在小鼠中NEXT缺乏会引发进行性和致命的神经发育异常，进而导致生育能力下降和寿命缩短。而在斑马鱼中，NEXT障碍会引发运动神经元和小脑结构的缺陷。NEXT组分的突变也与人类疾病有关，从神经系统疾病，如脊髓运动神经病和智力残疾，到癌症和短端粒疾病。

NEXT由MTR4、RBM7和ZCCHC8三个核心亚基组成。MTR4属于2 DExH-box 3'到5' RNA解旋酶超家族，与核外显体的功能密切相关，是包括TRAMP和PAXT/PPC在内的几种RNA适配复合物的核心成分。MTR4的解旋酶核心是两个类似RecA的ATP酶模块 (RecA1和RecA2) 的环状排列，具有翼状螺旋(WH)和螺旋束 (HB) 结构域。独特的是，MTR4包含一个拱形突起，带有KOW域，通过一个细长的反平行螺旋-螺旋motif (Stalk) 连接到解旋酶核心。人MTR4解旋酶活性较弱，但结合到核外泌体或与RBM7和ZCCHC8形成复合物后解旋酶活性增强。RBM7是一种RNA结合蛋白，最初被描述为与剪接因子相关，可能针对内含子RNA进行衰变。它有一个单一的RNA识别基序 (RRM)，可以结合单链RNA。虽然RBM7也可以与其他RNA序列相互作用，但它更倾向于结合在NEXT底物的非聚腺苷化或短聚腺苷化3'端上游约20个核苷酸的富尿苷基序。由于U-rich基序不是严格要求的，观察到的特异性可能反映一种构象更倾向于灵活的单链RNA。RBM7被ZCCHC8招募到MTR4, ZCCHC8是一种具有单一锌关节基序的蛋白，它结构中包含于RBM7结合的PSP结构域和结合MTR4 CTD结构域。

在本研究中，作者首先通过大肠杆菌表达体系分别获取了NEXT的三个核心组分，然后体外重组后得到NEXT结合RNA底物的复合物，接着通过冷冻电镜单颗粒重构技术解析了复合物的结构。在结构中，NEXT复合物呈现出二聚体构想。其中，MTR4解旋酶的核心结构域（RecA1, RecA2, WH和HB）紧密折叠并形成结合RNA的通道。ZCCHC8作为脚手架介导了NEXT的二聚体结构形成。接下来，作者通过解析和比较NEXT结合不同RNA底物的结构和相互作用界面的分析研究，发现该结构代表了RNA识别的早期步骤，在3'端被捕获后，但在其从MTR4挤出之前，这一过程可能依赖于ZCCHC8 CTD重塑和/或外泌体招募。此外，作者还通过qPCR、RNAseq等生化实验分析发现NEXT复合物的同源二聚体形成后解旋酶活性明显增加。进一步的机制研究发现，RBM7的 RRM domain和ZCCHC8 的ZK domain都在底物识别中发挥了重要的作用。删除ZCCHC8的HD domain后改变了靶向底物的水平。与ZCCHC8介导的NEXT二聚化一致，作者表明癌症相关的ZCCHC8-ROS1融合可二聚并激活该激酶。最后，该结构揭示了ZCCHC8支架覆盖了RNA易位和MTR4与核外泌体相互作用的重要表面，这表明在NEXT释放RNA进行衰变之前，需要重新构建层次相互作用。

总的来说，本研究通过生化和结构证据阐明了人类NEXT在RNA监测中的作用，并为NEXT在多种人类疾病中的功能研究奠定了结构基础。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.016

制版人：十一

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