微生物所发现真菌跨界Small RNA作用新机制

自然界中，不同物种间进行着广泛的生物大分子交流，包括蛋白、DNA和RNA等(Zhao and Guo, 2019)。近年来，由跨界传递的small RNA（sRNA）介导的RNA沉默（RNA silencing or RNA interference，RNAi）受到了广泛关注。

RNAi是真核生物基因表达调控的保守机制。研究表明，sRNA在植物-病原菌间进行双向传递，并在受体细胞中发挥作用 (Hua et al., 2018)。一方面，植物将自身保守的sRNA传递到病原菌细胞抑制致病基因表达，影响致病性；另一方面，病原菌释放sRNA效应子，利用宿主RNAi系统影响抗性途径，抑制宿主免疫 (Zhao and Guo, 2022; Zhu et al, 2022)。

中国科学院微生物研究所郭惠珊团队以棉花黄萎病为研究对象，在国际上首次报道了植物-真菌跨界抗病RNAi。团队发现，棉花传递自身保守的microRNA（miRNA）到致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)细胞内，剪切并降解致病基因，减低黄萎病病症(Zhang et al., 2016)。最近，郭惠珊团队发现大丽轮枝菌产生大量来源于rRNA的sRNA，其中一条24-nt sRNA——VdrsR-1被分泌到宿主植物细胞，并特异的与植物AGO1蛋白结合靶向植物miR157d的前体MIR157d。意外的是，VdrsR-1靶向MIR157d提高了miR157d的积累，miR157d靶标基因SPL13A/B表达受到抑制，延迟了宿主植物营养生长到开花的转变（图1）。

图1. 大丽轮枝菌跨界sRNA ——VdsrR-1作用方式示意图。

利用轮枝菌侵染AGO1转基因拟南芥，并对宿主AGO1蛋白结合的sRNA进行测序分析发现，大量轮枝菌sRNA进入宿主细胞并与AGO1蛋白结合。靶标基因预测表明，这些sRNA不仅能够靶向与宿主免疫相关的基因，还影响了与植物生长发育相关的途径（图2）。

图2. 轮枝菌跨界sRNA潜在靶标GO聚类分析。(Zhang et al., 2022)

进一步分析发现，来源于大丽轮枝菌rRNA的24-nt sRNA——VdrsR-1能够靶向miR157d的前体MIR157d。Northern blot结果显示，大丽轮枝菌rRNA产生大量不同长度的sRNA；RT-PCR实验证实，24-nt的VdrsR-1被分泌到宿主细胞并特异的与植物AGO1蛋白结合（图3）。

图3. 轮枝菌rRNA产生的24-nt 跨界sRNA——VdrsR-1特异性的与宿主AGO1蛋白结合。（A）VdrsR-1靶向miR157d前体MIR157d（B）轮枝菌rRNA产生大量不同长度sRNA（C）VdrsR-1与宿主AGO1蛋白相结合（miR162为正对照，siRNA1003和VdmilR-1为负对照）(来源于Zhang et al., 2022)。

一般来说，植物sRNA靶向并剪切靶标基因mRNA，剪切片段随后会被降解。为了验证MIR157d是否为跨界sRNA VdrsR-1的靶标，利用RT-qPCR检测发现：与对照植物相比，轮枝菌侵染的拟南芥中MIR157d的积累量降低。意外的是，miR157d成熟体积累量升高，对应的靶标基因SPL13A/B积累量降低（图4）。以上结果表明，轮枝菌跨界sRNA VdrsR-1靶向MIR157d，但并不是降解MIR157d，而是促进其加工，提高了miR157d的积累。

图4. 跨界VdrsR-1靶向MIR157d促进miR157d成熟体积累。（A）轮枝菌侵染的植物中MIR157d积累量降低（B）轮枝菌侵染诱导了miR157d成熟体的表达（C）轮枝菌侵染抑制了miR157d靶标基因SPL13A/B表达。(来源于Zhang et al., 2022)

利用烟草瞬时表达系统，进一步证明了VdrsR-1和MIR157d共同表达提高了miR157d成熟体的积累量（图5）；而VdrsR-1与MIR157dm（突变了VdrsR-1的作用靶点）共同表达，不会提高miR157d积累量；VdrsR-1与MIR157dasR-1（MIR157d前体中miR157d序列替换为asR-1），同样能促进asR-1的积累。以上结果进一步证明：MIR157d是真菌跨界VdrsR-1的靶标基因。VdrsR-1靶向MIR157d促进miR157d成熟体积累，其促进作用与miR157d成熟体序列不相关，可能与MIR157d高级结构相关。

图5. 烟草瞬时表达系统中VdrsR-1剪切MIR157d促进miR157d成熟体积累。（A）真菌跨界VdrsR-1靶向MIR157d及突变体示意图（B）烟草瞬时表达系统中，VdrsR-1促进miR157d成熟体积累，抑制靶标基因表达（C）VdrsR-1促进asR-1积累。(来源于Zhang et al., 2022)

前期研究报道，miR156/157家族miRNA调控植物从幼苗到成苗以及开花的转换过程。对大丽轮枝菌侵染植物的表型观察发现，大丽轮枝菌侵染拟南芥抑制植物生长发育，推迟了植物开花时间。利用VIGS技术在拟南芥中高表达VdrsR-1，发现与对照组相比，高表达VdrsR-1开花时间明显延迟（图6）。以上结果证实，真菌跨界VdrsR-1进入植物AGO1蛋白，调控MIR157d-miR157d-SPL13A/B模块，延长植物营养生长阶段，推迟植物开花。

图6. 跨界VdrsR-1影响了植物营养生长到开花的转变。（A）轮枝菌侵染抑制了宿主植物生长（B）VdrsR-1植物开花延迟。(来源于Zhang et al., 2022)

以上研究受到国家自然基金委国际合作项目、重点项目和面上项目，以及中国科学院先导培育项目支持。研究成果发表于Frontiers in Plant Science杂志，郭惠珊研究组博士研究生张博森为论文第一作者，赵建华副研究员和郭惠珊研究员为共同通讯作者。河北大学联合培养硕士研究生李颖超参与了该论文的研究。

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.847086/full

参考文献

Hua, C., Zhao, J.H., and Guo, H.S.(2018). Trans-Kingdom RNA Silencing in Plant-Fungal Pathogen Interactions. Molecular plant11,235-244.

Zhang, B.-S., Li, Y.-C., Guo, H.-S., and Zhao, J.-H.(2022). Verticillium dahliae Secretes Small RNA to Target Host MIR157d and Retard Plant Floral Transition During Infection. Frontiers in Plant Science13.

Zhang, T., Zhao, Y.L., Zhao, J.H., Wang, S., Jin, Y., Chen, Z.Q., Fang, Y.Y., Hua, C.L., Ding, S.W., and Guo, H.S.(2016). Cotton plants export microRNAs to inhibit virulence gene expression in a fungal pathogen. Nature plants2,16153.

Zhao, J.H., and Guo, H.S.(2019). Trans-kingdom RNA interactions drive the evolutionary arms race between hosts and pathogens. Current opinion in genetics & development58-59,62-69.

Zhao, J.H., and Guo, H.S.(2022). RNA silencing: From discovery and elucidation to application and perspectives. J Integr Plant Biol64,476-498.

Zhu, C., Liu, J.-H., Zhao, J.-H., Liu, T., Chen, Y.-Y., Wang, C.-H., Zhang, Z.-H., Guo, H.-S., and Duan, C.-G. (2022).A Fungal Effector Suppresses the Nuclear Export of Ago1–Mirna Complex to Promote Infection in Plants. Proceedings of the National Academy of Sciences119,e2114583119

第一作者简介

张博森，中国科学院微生物研究所郭惠珊研究组博士研究生，主要研究方向是植物RNA沉默和植物—病原相互作用。