《食品科学》：中国检验检疫科学研究院陈颖研究员：DNA提取前处理方法对萨拉米香肠中细菌种群结构的影响

萨拉米香肠是以猪、牛肉等为原料，按照一定肥瘦比例，加入盐、大蒜、胡椒、辣椒等香料调味，经菌种发酵后在特定条件下干燥制成的干发酵香肠。发酵香肠的风味不仅取决于原材料和调味料，更与其中的微生物密切相关，因此了解其中微生物群落结构是风味研究及安全质控的关键。高通量测序技术与传统微生物群落研究相比，可对样品中微生物进行大规模平行测序，能够客观反映样品中群落构成和多样性。为保证结果的可靠性以及不同研究之间结果的可比性，需要建立统一标准化的高通量菌群分析实验流程。其中，DNA提取方法的比较是近年来研究关注点之一，而样品前处理是DNA提取的第一步。

为此，来自中国检验检疫科学研究院的姬庆龙、赵贵明、陈 颖*等人使用3种不同前处理方法（直接提取法（M0）、拍击均质法（M1）和振荡珠磨法（M2））提取萨拉米香肠细菌DNA，采用MiSeq高通量测序技术对其细菌种群结构进行分析。通过比较3种方法提取的样品中细菌种群差异，筛选出较适合的前处理方法，以期为建立统一标准化的发酵香肠高通量菌群分析实验流程提供参考。

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DNA提取结果

M0提取的DNA平均质量浓度为（361.5±9.36）ng/μL，M1为（15.56±6.79）ng/μL，M2为（23.77±2.21）ng/μL。3种方法得到的DNA的A260 nm/A280 nm比值均在1.9左右，表明纯度良好。使用引物343F/806R扩增后，3种方法均可扩增出450 bp的目的条带。虽然M1和M2的DNA质量浓度低于M0（混有样品组织DNA），但3种方法均满足样品菌群结构分析的建库需要

02 OTU分布及α多样性分析

为突出3种前处理方法间测序结果的差异性，将2个平行对照的数据合并成1个样品数据进行分析。M0、M1和M2平均每个样品测得原始序列为33 722、47 135、44 033 条，去除嵌合体、短序列后得到最终优质序列数目分别是29 685、42 343、39 768 条，按照97%相似性，聚类共产生417个OTU，经过抽平处理剩余405个OTU。如图1所示，M0、M1和M2的OTU数分别为319、206和253，其中M0独有OTU数为90个，M1独有OTU数为33个，M2独有OTU数为38个。方法间共有的OTU数为129个，占样品总数的31.85%；任意两种前处理方法共有OTU数均在140个以上，M0和M2的共有OTU数最多（200个），占样品总数的49.38%。非共有OTU虽然数量很多，但丰度却极低，代表并不是主要菌群。

每个样品的文库覆盖率均为100%，表明目前数据量的分析符合要求，已测数据可以反映萨拉米香肠样品中绝大多数的细菌物种信息，增加测序数据已无法找到更多的OTU，详细见表2。Chao1指数反映样品微生物种群的丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映样品微生物种群的多样性，表现微生物种群的均匀度。结果表明，M0、M1和M2的Chao1指数分别为177.93±31.02、120.76±28.60、166.96±15.63；Shannon指数分别为2.79±0.22、2.95±0.31、3.25±0.30；Simpson指数分别为0.70±0.06、0.78±0.05、0.81±0.05。Chao1指数最高的是M0，同样品3个方法间最多相差145.98，证明M0可获得更高的物种丰富度；种群分布最均匀、种群多样性最高的是M2，同样品方法间Shannon指数最多相差0.83，而Simpson指数相差最多0.15。证明不同前处理方法可对样品的细菌种群结构产生影响。

03

细菌组成分析

在门分类水平上，3种前处理方法共有13个门（含无法鉴定），厚壁菌门和变形菌门为主要优势细菌，此外还存在少量的放线菌门和拟杆菌门等，与国内外同类研究一致。3种前处理方法在门水平上种群结构相似，但丰度上存在差异，其中厚壁菌门占绝对优势，相对丰度分布为M0（85.03%）＞M2（79.21%）＞ M1（68.70%）；变形菌门的相对丰度分布分别为 M1（22.03%）＞M2（18.09%）＞M0（10.09%）；放线菌门的相对丰度分布分别为M1（8.37%）＞M0（2.83%）＞M2（1.02%）。

在科分类水平上，M0、M1和M2分别有84、74、81个科，共有科为59个，占比99.5%以上。非共有科所占比例极低，对科分类水平上种群结构影响不大，但优势科的相对丰度存在差异（表3）。M0的优势科细菌（相对丰度＞1%）为乳杆菌科、链球菌科、葡萄球菌科、明串珠菌科、肠杆菌科和短杆菌科，所占比例总和为94.19%。M1的优势科与M0相同，但相对丰度存在差异，所占总比例为97.13%。与M0相比，M1的乳杆菌科和链球菌科相对丰度偏低，但肠杆菌科和短杆菌科的相对丰度显著升高。M2的优势科与M0和M1略有不同，黄杆菌科的相对丰度（1.32%）大于短杆菌科（0.59%），优势菌占比94.92%。

如图2所示，在属分类水平上，M0、M1和M2分别有112、104、115个属，共有属为70个，占比99%以上。M0有8个优势菌属，分别为乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、魏斯氏菌属、乌拉尔菌属、柠檬酸杆菌属和短杆菌属，所占比例总和为90.87%。M1则有11个优势菌属，除上述8个菌属外，还包括巨大球菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属，所占比例总和为93.31%。而M2有9个优势菌属，与M0相比，多了肠杆菌属和克罗诺菌属为优势菌属，而其短杆菌属相对丰度小于1%，其优势菌属占比91.53%左右。3种前处理方法在属水平对萨拉米香肠样品的种群结构及相对丰度差异显著（P＜0.05）

04

结论

在门和科水平分析，不同前处理方法获得的样品细菌种群结构相似，但丰度上存在差异；但在属水平上，不同的前处理方法可影响后续种群结构分析的结果。M0可增大优势菌的丰度及多样性，可应用于检测样品在成熟过程中存在过的细菌。而M1和M2除去了游离DNA，只留下具有完整细胞结构的细菌菌体，更能反映出样品在取样时的细菌种群结构。当样品结构相对均一时，M1与M2的菌群结构和丰度趋于一致。应该尽早建立统一的高通量测序标准流程，以确保数据的可靠性以及不同研究之间结果的可比性。

本文《DNA提取前处理方法对萨拉米香肠中细菌种群结构的影响》来源于《食品科学》2022年43卷4期113-118页，作者：姬庆龙，赵贵明，王 娉，赵勇胜，赵晓美，杨海荣，陈 颖*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201119-201。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑/责任编辑：张睿梅

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