时隔十年，科学家在大鼠中实现体外配子发生

撰文丨言笑

哺乳动物的生殖细胞在雌性中分化为卵母细胞，在雄性中分化为精子。卵母细胞和精子融合形成受精卵，然后发育成新的个体，从而将其遗传和表观遗传信息传递给下一代。在发育过程中，生殖细胞经过表观遗传重编程，在受精时获得全能性，以高保真度维持基因组信息，并且通过减数分裂重组产生基因组多样性。为了探索生殖细胞在发育过程中获得的这些独特功能的分子和系统层面的机制，科学家希望在实验室中人工培育出精子和卵子，以深入了解基本繁殖过程，寻找治疗不孕症的方法。

精子和卵子的前体是原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs），产生于原肠胚前期。一直以来，科学家们都试图用上胚层干细胞诱导出PGCs进而培育出精子和卵子，但都遭到失败。2011年，一项开创性的研究通过将小鼠多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）分化成能够在体内配子发生的PGC-样细胞（primordial germ cell-like cells,PGCLCs），在体外重建了小鼠生殖细胞规范，并通过辅助生殖技术产下正常幼鼠【1】。十年来，小鼠PSCs在体外重建生殖细胞发育（体外配子发生（in vitro gametogenesis,IVG））的研究取得了显著进展，然而，尚未报道任何其他物种的全功能体外衍生PGCLCs能够产生配子。

大鼠和小鼠具有类似的重要特征，但它们是不同的物种，在生理学、药理学、认知和行为方面均存在重大差异【2】。分离具有大鼠种系能力（germline-competent）的ESCs也更具挑战性【3-4】。2022年4月8日，来自日本东京大学的Toshihiro Kobayashi团队与国家生理科学研究所的Masumi Hirabayashi团队合作在Science杂志上在线发表了一篇题为Functional primordial germ cell-like cells from pluripotent stem cells in rats的文章，研究人员成功地从大鼠PSCs中诱导出了功能性PGCLCs，将PGCLCs移植到无种系细胞的大鼠生精管中时，会产生功能性精子，并繁殖出有活力的后代。

首先，作者从大鼠ESCs（rESCs）中诱导了rEpiLCs（epiblast-like cells）：rESCs经过72h培养，表现出rEpiLCs命运的关键特征——Prdm14-H2BVenus（naïve多能外胚层和ESCs标志物【5】）表达降低，OTX2（植入后的外胚层干细胞标记物【6】）和CD47（外胚层干细胞中上调的质膜标记物【6】）的水平升高，OCT3/4（核心多能因子）没有显著变化（图1A-B）。通过对rEpiLCs进行RNA测序（RNA-seq），并将其与rESCs进行比较，作者鉴定了rESCs和rEpiLCs中的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），发现由naïve rESCs诱导的rEpiLCs具有体内植入后外胚层细胞的特征（图1C）。

图1. 从rESCs中诱导产生rEpiLCs

随后，作者探究了rPGCLCs的诱导和成熟过程。将解离的rESCs在rEpiLCs培养基中培养48-72h以形成聚集体，这些聚集体被转移到含有BMP4（一种对PGC命运至关重要的细胞因子【7】）的PGCLCs培养基中继续培养。通过RNA-seq分析第3天（d3）rPGCLCs的转录组，将其与rESCs、rEpiLCs、体内大鼠外胚层和rPGCs进行比较，d3 rPGCLCs表达了PGCs中包含的所有标志物和多能基因，表明诱导的rPGCLCs与体内rPGCs的发育阶段相同（图2C）。然后，作者使用rPGCLCs和性腺体细胞重建了性腺环境【8】，证实rPGCLCs可以成熟为晚期PGCs。进一步，作者检测了培养物中的DNA甲基化和组蛋白甲基化的动态情况，发现rPGCLCs培养物中的表观遗传变化与体内rPGCs类似（图2E）。

图2. 从rEpiLCs诱导和成熟rPGCLCs

最后，作者探索了雄性rPGCLCs在移植到睾丸后是否能在体内产生功能性精子。在移植后8-11周，就出现了peanut agglutinin（PNA）阳性圆形精子和成熟精子，表明rPGCLCs可以在体内完成精子发生。随后作者将圆形精子和睾丸精子注入野生型大鼠的卵母细胞中来证实rPGCLCs衍生的睾丸生殖细胞的发育潜力。胚胎移植足月后，可产下活的健康的后代，并将来自rESCs的N3T和AG转基因都成功传递给后代（图3C-E），说明体外诱导的rPGCLCs是功能性的，能够产生成熟的配子。

图3. rPGCLCs功能验证

人PGCLCs（hPGCLCs）通过与小鼠胚胎卵巢体细胞或小鼠胚胎睾丸体细胞（异种重建卵巢或重建睾丸）一起培养，可分别分化成早期卵母细胞或精原细胞前体细胞，但不能发展到配子阶段，这可能是受限于培养条件或体内缺乏合适的模型来测试其功能，该研究中的系统为测试体外生殖细胞的生育能力和发育潜力提供了一个很好的平台。同时，大鼠在生理上比小鼠更类似于人类，该研究中的体外配子发生（IVG）系统为筛选代间或跨代遗传疾病致病因素提供了机会。

https://science.org/doi/10.1126/science.abl4412

制版人：十一

参考文献

1. K. Hayashi, H. Ohta, K. Kurimoto, S. Aramaki, M. Saitou,Cell146, 519-532 (2011).

2. T. J. Aitman et al.,Nat. Genet.40, 516-522 (2008).

3. M. Buehr et al.,Cell135, 1287-1298 (2008).

4 P. Li et al.,Cell135, 1299-1310 (2008).

5. T. Kobayashi et al.,Development 147, dev.183798 (2020).

6. P. J. Rugg-Gunn et al.,Dev. Cell22, 887-901 (2012).

7. Y. Ohinata et al.,Cell137, 571–584 (2009).

8. K. Hayashi et al.,Science338, 971–975 (2012).

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