Science | 打开细胞说“亮”话：内源荧光标记蛋白质大型图谱数据库OpenCell

撰文丨十一月

蛋白质是基因表达的产物，同时也是组成细胞的“分子砖头”。但是如何系统性地对细胞中不同蛋白质进行大规模刻画，仍是是科研界的一大挑战。为此，美国陈·扎克伯格生物医学中心在Science发文题为OpenCell: Endogenous tagging for the cartography of human cellular organization，通过内源荧光标签标记的方式建立了大规模人类蛋白质组组织模型OpenCell，并建立了交互网站（opencell.czbiohub.org）方便科研社区的研究。

任意给定蛋白质的亚细胞定位以及相互作用网络都是其生物学功能的关键方面。蛋白质定位于不同亚细胞区域，使得空间上细胞中的功能得以高效进行。想要对特定蛋白进行可视化分析，其中一个策略就是给蛋白加上荧光标签。这些标签可以帮助在细胞中进行可视化定位，另外也可以通过免疫纯化-质谱的方式对目标蛋白质的相互作用组进行检测，而最近基因编辑的技术也为目标蛋白质的内源生理学水平下进行荧光标记提供了重要工具。

确定实验策略后，作者们希望建立一个工程化细胞文库（图1），通过引入 split-mNeonGreen2工作系统【1】的方式构建荧光标记的HEK293T细胞品系中不同的人类基因。Split的荧光蛋白能够大大简化分子克隆的流程，但同时又能够产生融合荧光蛋白，确保在内源的生理水平对基因表达进行调控。OpenCell数据库的具体构建流程简而言之是首先根据文献或者结构生物学分析决定将荧光标签加在目标蛋白的N端或者C端，然后分离出基因编辑的细胞，通过活细胞三维共聚焦显微镜的成像、免疫纯化-质谱以及二代测序等方式对该目标蛋白进行刻画，并进一步地开放相关开源软件以及优化仪器的可扩展性。需要特别提出的一点是，为了更好地设计和指导RNA选择和同源供体序列设计，作者们开发了用于CRISPR设计的软件crispycrunch，以及设计了自动化获取显微镜数据的工作流程。这些将大大解放实验室的劳动力并且能够以更高效和更具有一致性的方式确保数据的质量。

图1 OpenCell数据文库构建流程

由此，作者们总共靶向了1757个蛋白，其中1310个（75%）蛋白能够通过荧光成像的方式检测到。通过质谱对蛋白质进行定量分析，作者们确认OpenCell数据库可以在确保生物学功能以及接近内源生理水平的条件下进行蛋白质荧光标记。

随后作者们希望通过质谱的亲和富集系统性地建立蛋白质相互作用网络。通过总共对5292个诱饵以及猎物蛋白以及对每组相互作用进行化学计量学分析，作者们建立了蛋白质相互作用组并对相互作用组进行功能学的聚类。蛋白质组的聚类分析有助于更全面地开发蛋白质功能，从而了解以前未被深入刻画的蛋白质的功能。举例来说，作者们发现NHSL1、NHSL2以及KIAA1522可能会在肌动蛋白组装过程中发挥作用；蛋白ROGDI曾经被报道与KohlschuetterToenz综合征有关，这是一种癫痫以及精神运动退化相关的隐性发育疾病，但是没有明确的分子机制和功能，作者们鉴定发现ROGDI与其他三个蛋白DMXL1、DMXL2和WDR7与v-ATP酶溶酶体质子泵相互作用模式相似，这说明ROGDI可能是通过影响质子泵组装过程发挥作用的。因此，该结果说明作者们所建立的数据库能够结合蛋白质相互作用以及相关文献来促进新的分子生物学机制的发现。

随后作者们希望对荧光标记的蛋白质组进行亚细胞定位的注释，首先通过将每个蛋白相较于15个独立的亚细胞定位比如核仁、中心体或者高尔基体等的一个或者多个来人工注释定位的模式（图2）。另外，作者们将得到的蛋白质亚细胞定位与人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）进行比对，确认75%的目标蛋白质定位与人类蛋白质图谱一致。随后作者们又对不同定位的蛋白质进行了功能特异性聚类分析，从而确定不同亚细胞定位与不同生物学功能之间的关系。具有特殊亚细胞定位的蛋白中，最为特别的是RNA结合蛋白，参与了包括P小体、中心体等多个亚细胞定位凝聚体的组装。

图2 细胞中15个不同的亚细胞定位模式

最后为了促进OpenCell数据库的广泛应用，作者们构建了一个交互式网站，可以提供对每个标记蛋白质的可视化三维荧光共聚焦图像、丰度以及相互作用图谱。

图3 OpenCell数据库的工作模型

总的来说，通过内源性荧光蛋白标记与蛋白质相互作用组学、荧光显微镜分析相结合的方式（图3），作者们构建人类蛋白质组学新数据库OpenCell，为每个蛋白质的亚细胞定位分布以及生物学功能等特征进行了联系。这一数据库为未知蛋白质表征、高通量筛选以及疾病过程的建模等提供了新的途径。

参考文献

1. S. Feng et al., Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling.Nat. Commun.8, 370 (2017). doi: 10.1038/s41467-017-00494-8; pmid: 28851864

https://doi.org/10.1126/science.abi6983