热点 | 外泌体：解读"抗衰老"医美新宠儿

近期，干细胞外泌体非常的火，被誉为“抗衰老”的新风口。那么干细胞外泌体到底是什么？如何发挥作用？可否用于护肤品？外泌体又是如何提取的...等等？

世界卫生组织说：“皮肤衰老的本质是细胞的衰老”。随着年龄的增长和身体机能的变化，体内的细胞会逐渐发生损伤、失活，从而引起组织衰老。冰冻三尺非一日之寒，抵御皮肤组织的衰老需要从本源上解决并循序渐进。外泌体是细胞所分泌的超微小囊泡，专门负责投递保持细胞健康活力的营养物质和信号，对受损细胞、失活细胞进行修复和唤醒，重建细胞屏障，激活皮肤细胞分化、促进再生，从源头上实现抗衰。

随着人类的进步和发展，越来越多前沿科学研究正在走进人们的日常生活，不断为人们所知、不断为人们所用。近几年，一类纳米尺寸的细胞囊泡——外泌体（exosome）受到了科学家们的广泛关注。对其的研究发现表明，外泌体具有与细胞膜类似的膜结构，在细胞之间的交流中具有重要意义，并且可以调控组织微环境的炎症水平并且促进再生。

外泌体的研究历史

上世纪80年代，外泌体首次被科学家发现，并且在很长时间内被认为是细胞的代谢产物。由于当时分析和研究的手段受限，外泌体的功能并不明晰。直到21世纪，科学家们才通过各种新技术，分离和提取出外泌体，并发现外泌体在细胞之间充当重要的沟通介质，进而影响细胞而至组织的生理活动。

所以要说外泌体，我们先从“囊泡运输”的研究历史说起。

1974年，发现溶酶体，发现分泌蛋白的合成、运输和分泌途径 ，可以称“囊泡运输”的最早研究，获诺贝尔生理学或医学奖。

1983年，在绵羊网织红细胞中，首次发现外泌体。

1985年，发现胆固醇代谢囊泡调控，发现“囊泡运输”中细胞膜受体的存在，获诺贝尔生理学或医学奖。

1987年，外泌体正式被承认，被命名，从此它叫"exosome"。

1999年，发现分泌蛋白进入内质网需要信号肽引导，获诺贝尔生理学或医学奖。

2013年，发现并阐释细胞囊泡运输系统及其调控机制，获诺贝尔生理学或医学奖。

细胞外囊泡 （ extracellular vesicles, EVs）是机体远距离细胞间交流的一种手段。目前主要被分为3大类：外泌体、微囊泡和凋亡小体，临床研究中主要关注的是外泌体。外泌体就是细胞外囊泡的一种。自此，外泌体研究成为国际研究热点。

外泌体的产生与作用机制

一开始，细胞膜内陷形成早期核内体。接着，细胞将一些颗粒物质装到早期核内体中，形成晚期核内体。最后，晚期核内体与细胞膜特定部位融合后形成芽泡，将泡体中的外泌体释放到细胞外。至此，外泌体完成分泌。

外泌体可通过配体 - 受体相互作用，粘附到受体细胞表面，或者被受体细胞内吞或经过囊泡和细胞膜的直接融合，使外泌体内容物释放转移到靶细胞内。至此，外泌体完成从一个细胞到另一个细胞的转移。

外泌体发挥生物学效应的方式主要有两种：一是直接作用。外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体，产生信号复合体并激活胞内信号通路。二是递送作用。外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞，将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内，进而调控细胞的功能及生物学行为。

我们以前的科普文章里对外泌体有一个很好的比喻： 外泌体是一部货拉拉，装了自家一堆乱七八糟的东西 （里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白） ，然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，卸车完事。

外泌体的生物学特性

由于外泌体在再生医美领域显示出极大前景，这也迎来产业化合作的新浪潮，眼下外泌体似乎已经成为下一个生物医药的黄金赛道。科学家们普遍认为，外泌体具有其独特的生物学特征，可以反映来源细胞的表型。

不同细胞分泌不同的外泌体，因此外泌体的应用是多种多样的。一方面，外泌体被认为是多种癌症的疾病诊断生物标志物。外泌体独特的miRNA谱图和疾病载体作用，使得其频繁出现在卵巢癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌。另一方面，外泌体也可以作为细胞信号传导的有效媒介而广泛用于医学再生领域。例如，它们能够将RNA和蛋白质的信息从来源细胞转移到周围环境中的其他细胞。实验证明，来自小鼠胚胎干细胞的外泌体在体外促进了小鼠造血干细胞的存活和扩展，同时也上调了受体细胞中与多能性相关的转录因子。干细胞来源的外泌体与生物材料相结合，促进骨组织以及关节软骨的修复和再生。

在皮肤组织再生中，外泌体的应用尤其广泛。如脂肪源外泌体能通过减少IFN-α的分泌而发挥免疫抑制作用，从而抑制T细胞的激活。此外，外泌体含有免疫调节蛋白如TNF-α、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），从而通过良好的炎症调节保证了伤口愈合。而在皮肤愈合过程中，外泌体则能通过优化成纤维细胞特性加速皮肤伤口愈合。在一项研究中发现，外泌体上调199个miRNA，下调93个miRNA，促进真皮成纤维细胞增殖和分化，加速皮肤再生。

总而言之，干细胞来源的外泌体作用广泛。在皮肤再生中，外泌体可以通过调控炎症、促进皮肤修复等多方面提供作用；在疾病发展中，外泌体也参与多种病理通路。在未来，无论是组织再生、皮肤修复、还是疾病研究，外泌体都将在其中扮演重要角色。

外泌体的鉴定与提取

鉴定外泌体形态大小的一个常规手段是电镜观察，电镜下的外泌体呈典型的杯状形态。

有人总结过，外泌体提取方法包括：超速离心法、基于尺寸大小的技术、免疫吸附的分离技术、沉淀法、基于微流控的分离技术。

超速离心法是分离外泌体的标准方法 。在4℃条件下依次以300G，2000G，10000G的转速离心，依次去除 细胞和细胞碎片等，再以100000G超速离心得到外泌体。但离心法每次处理的样本量较小， 而且反复高速离心会导致外泌体破裂影响质量。

几乎所有细胞都可以释放外泌体。如果这个外泌体是间充质干细胞分泌的，我们就叫间充质干细胞外泌体 （ MSC-exo） 。MSC-exo表达所有外泌体共同表达的相关标志物：细胞骨架蛋白质 （微管蛋白和肌动蛋白），同时也表达MSCs的表面标志物 （如CD90、CD73）。

和间充质干细胞一样，MSC-exo也包含脂肪间充质干细胞外泌体、脐带血间充质干细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体等。但无论是哪种来源的MSC-exo，其功能大同小异。当然，不排除有些外泌体具有组织特异性。

外泌体与皮肤抗衰老的关系

首先，从皮肤衰老说起？

我们先从皮肤衰老说起。人类皮肤的衰老是经历一个复杂的过程，主要是由内在机制和外在影响的相互作用导致引起的。

皮肤衰老是从表皮层到真皮层的衰老，比如角质形成细胞增殖能力减退、成纤维细胞功能异常、乳头层变平、细胞外基质成分及含量的变化等是内外源性皮肤老化共同的病理生理改变。

内源性老化表现为皮肤干燥、出现细纹、胶原纤维和弹性纤维减少以及皮下脂肪变薄。这是正常皮肤老化，随着年龄增长自然发生的。外源性老化表现为皮肤干燥、出现大皱纹、皮肤松弛、弹性下降、粗糙、色素不均匀。这归因于环境因素，尤其是紫外线。

整个皮肤衰老的原因，通常归于基因变异，端粒异常，蛋白质和细胞损伤增加，炎症，细胞衰老加剧，内源性干细胞耗尽等问题。

那么，如何对抗皮肤衰老？

从理论机制上讲，实现抗皮肤老化的可能途径有促进角质形成细胞的迁移和增殖、促进成纤维细胞增殖、 抑制基质金属蛋白酶 （MMPs） 活性和减少皮肤氧化应激反应。

一、关于表皮层方面

角质形成细胞是表皮层的主要细胞，决定表皮层 的厚度，决定皮肤自愈能力的强弱。在皮肤损伤后第三天，成纤维细胞开始产生细胞外基质 （包括纤连蛋白，I 型和III 型胶原蛋白等） 。同时，上皮细胞开始增殖并向受伤区域边缘迁移，加速伤口闭合，减少皮肤感染。因此，细胞增殖和皮肤再上皮化对皮肤再生至关重要。

研究表明，来自不同来源MSC-exo都可以促进皮肤细胞增殖，并加速表皮再生。体内实验也证明， 脂肪间充质干细胞外泌体 （ADSC-exo）可促进角质形成细胞在体外的迁移和增殖，提高皮肤伤口愈合速度，增加表皮的自愈能力。

二、关于真皮层方面

1. 促进成纤维细胞的增殖能力

成纤维细胞是真皮层主要的细胞，可产生细胞外基质 （ECM） 。成纤维细胞在体内几乎不增殖，其功能受损及细胞外基质的改变与外源性皮肤老化密切相关。随着年龄增长，人体真皮层成纤维母细胞的数量和活性是呈现下降趋势。外泌体可增强成纤维细胞的增殖能力，具有浓度依赖性，可逆转紫外线诱导的成纤维细胞老化，但对内源性老化因素所致细胞衰老作用不明显。

2. 抑制基质金属蛋白酶（MMPs）

基质金属蛋白酶 （MMPs） 由成纤维细胞、内皮细胞等合成，主要负责细胞外基质的降解，尤其是构成真皮结构的胶原纤维与弹力纤维，故MMPs是调节皮肤光老化的主要靶标之一。MSC-exo对MMPs的调节能减少真皮层弹性和胶原纤维的损伤，改善真皮层老化。

3. 通过减少氧化应激来延缓皮肤衰老

紫外线辐射可产生大量ROS （ ROS，即活性氧，是细胞代谢的产物，主要是各种氧化物，包括过氧化氢、超氧化物阴离子、羟自由基等），影响真皮成纤维细胞功能，诱导MMPs合成，损伤细胞外基质成分（ 如胶原蛋白、弹力蛋白等）。衰老成纤维细胞较正常细胞可产生更多ROS。研究发现，脂肪间充质干细胞外泌体 （ADSC-exo）可减少ROS产生。外泌体在ROS的产生、清除上具有一定功能，通过抑制ROS能减少皮肤的氧化应激损伤，给改善皮肤衰老带来了新的希望。

Cell Metabolism 的一篇研究提到， 年轻细胞分泌的小细胞外囊泡（sEV） 可以通过减少氧化应激来改善老年细胞的衰老。从外泌体出发，利用外泌体蛋白质组学技术阐明了年轻细胞的sEV具有改善衰老相关细胞损伤的潜力，为抗衰老机制研究提供了新视角。

外泌体在护肤领域前景

1. 外泌体是否允许直接添加到护肤品？

不允许。 目前干细胞和细胞提取液都不能作为化妆品原料。但大势所趋，随着技术的发展和市场的迫切需求，在外泌体标准化规模化制备后，有可能作为化妆品新原料使用，希望各位同仁积极探索。同时，外泌体来源于细胞，非普通的化妆品原料厂所能制备生产，行业技术壁垒较高。

2. 外泌体如果可以添加在护肤品中，如何配方？

护肤品成分很复杂，包括增稠剂，酸碱调节剂，防腐剂，油脂类，香料，乳化剂、保湿剂等等。如果要用外泌体作为活性成分，就要精简成分，讲究原汁原味，要求外泌体护肤品配伍不能影响外泌体活性。当然护肤品剂型的选择，也很重要。

3. 如何保证护肤品中外泌体的活性?

外泌体对温度有严格的要求，-20°C下可储存6个月，-80°C可长期保存。常温下，外泌体里面的活性成分容易降解。所以，市场上号称可常温保存，并称有保存技术的所谓外泌体产品，多数是假货。

然而为了运输和储存方便，外泌体护肤品在常温与低温的保存需要进一步研究探索。目前看来只有冻干粉，凝胶剂冷藏的方式才可在短期内保证其活性，但含量有限 。

4. 如果可以做护肤品，外泌体浓度是不是越高越好？

显然不是。 这需要进行科学的安全性和有效性评价，选择出一个最佳浓度。

这个问题牵扯比较多，涉及工艺开发体系。比如培养体系的影响，比如不同组织来源的影响，比如不同细胞代数的影响，比如生长因子群间的相互影响。这些都是我们亟需探索的方向。

5. 涂抹的外泌体护肤品能直接吸收吗？

显然不能！ 在皮肤屏障完整的情况下，直接涂抹外泌体很难穿过角质层进入皮肤里的。如何应用，透皮技术就显得尤为重要。让外泌体不破皮进入皮肤是研究者一直感兴趣的研究方向，未来，我们应该研究如何在安全前提下，能够促进有效成分渗透皮肤屏障。

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