Nature Plants | “旧壶装新酒”：向植物线粒体基因组中定向引入可遗传突变

撰文 | 十一月

责编 | 王一

基因编辑技术发展如火如荼的今天，想要对线粒体基因组进行编辑和操纵仍然不是一件容易的事情 【1】 。线粒体基因组相关工程技术的发展将极大地促进线粒体基因功能的研究，但目前植物线粒体基因组的转化技术仍然有一定的难度，一方面是由于缺乏线粒体特异性的标记基因，另一方面是线粒体基因组中同源重组效率的不确定性 【2】 。为了解决这一问题，德国马普研究所Ralph Bock研究组建立了能够向线粒体基因组引入可遗传突变的新方法——TALEN-GDM，并用其创制了可遗传的、线粒体基因组突变植株。相关成果以Targeted introduction of heritable point mutations into the plant mitochondrial genome为题发表在Nature Plants上。

由于缺乏线粒体基因组直接遗传转化的技术，并且CRISPR/Cas9的基因编辑技术依赖于RNA所介导的互补碱基对对基因组中靶位点的识别，因此也很难适应线粒体基因组编辑。也有人提出可以用tRNAs导入到线粒体，但其导入系统对RNA的结构、序列以及大小有相当严格的要求。因此作者们考虑能否用间接的方式引入突变。这个思路其实很有趣，就像当年明成祖朱棣决战时期从北京攻入南京，总是想着以前在济南吃过败仗，但攻打南京好像又必须经过济南因而踟蹰不前时一样遇到了思维盲点。对啊，攻打南京又不是必须经过济南，条条大路通南京嘛！所以最终朱棣取道徐州，一路杀入京城夺取了皇位。换句话来说，条条大路通基因编辑，东方不亮西方亮嘛！

所以最终作者们把目光集中在了以前的一项基因编辑技术TALEN上，该技术依赖于类转录激活因子效应物核酸酶，该方法被证明能够用于在线粒体中诱导基因组缺失 【3】 。作者们通过TALENs位点特异性基因组切割和具有抗TALEN切割能力的突变的基因驱动选择策略，希望来产生线粒体突变的烟草品系。作者们所关注的线粒体基因是NADH脱氢酶亚基基因nad9，之所以选择nad9是因为这个基因对光自养生长 （Photoautotrophic growth） 不是必须的，因此可以在诱导突变后进行无偏向性的恢复。

类转录激活子效应因子TALEs通过34个氨基酸重复序列串联排列来识别其目标序列，这些氨基酸重复序列共同形成了一个超螺旋结构。每个重复序列与目标序列中的一个碱基配对。碱基特异性由重复序列中的氨基酸残基赋予，这两个氨基酸残基被指定为重复变量双残基。当将TALE重复序列融合到限制性内切酶FokI的催化结构域时，设计用于在给定目标序列的相反链上以尾对尾方向结合的TALENs可以诱导特定位点的DNA双链断裂。为了检测靶向线粒体的TALENs是否能够切割烟草线粒体基因组，作者们设计了3对anti-nad9线粒体TALEN对，将相应基因序列插入载体中，转化植物核基因组 （图1） 。

图1 建立以线粒体nad9为靶点表达TALENs的转基因烟草株系

通过农杆菌介导的转化，导入烟草细胞，每个结构选择了大约30个转基因株系。通过nad9位点的DNA测序对该细胞株进行的初始基因分型显示，在预测的TALEN切割位点或附近没有出现突变。为了检测线粒体基因组是否发生了突变，采用nad9特异性探针进行Southern blot分析，确认线粒体基因组中的目标切割条带与预期一致。进一步的，通过提取植物总DNA再用绿豆外切酶进行处理，连接双链DNA适配子后进行测序，发现TALEN结合在nad9位点上进行了切割。

随后作者们通过建立基因驱动系统，通过组织培养多次再生循环的方式，使用线粒体基因组单细胞传代来增加突变体恢复的机率 （图2） 。这种基因驱动系统会促进线粒体基因组同源化 （Homochondriomy） ，这是突变基因组取代野生型线粒体基因组的现象。作者们综合分析发现在所构建的定向基因编辑系统中，线粒体突变非常快地达到基因组同源化，这可能是由于TALEN结合位点的突变具有强大的选择优势以及由此产生的基因驱动机制。因此，作者们将所建立的方法命名为基于TALEN基因驱动诱变TALEN-GDM。

图2 基因驱动系统促进线粒体基因组突变的发现与纯化

随后作者们想对所得到的突变体的表型进行研究。其中一个突变体E94K植株表现出复合体I积累减少。E94位点功能重要性与该位置在原核生物和真核生物中的高度进化保守性相一致。用特异性抗体对Nad9进行免疫检测，作者们发现E94K植物的蛋白质积累水平较低，大约只有野生型水平的60%，表明突变体Nad9蛋白稳定性降低。另外，E94K突变体的Nad9蛋白也表现出了电泳迁移率的改变，为蛋白质水平上提供了突变相关的直接生化证据。

总的来说，作者们通过引入TALEN基因编辑的方式对线粒体基因组靶向引入突变，能够将该方法的引入到烟草的线粒体nad9基因，并分离出携带单氨基酸取代的同源突变体。该工作为靶向线粒体基因组编辑提供了一种有效的方法，用于产生具有特定位点线粒体突变的植物。

参考文献：

1. Bock, R. Engineering plastid genomes: methods, tools, and applications in basic research and biotechnology. Annu. Rev. Plant Biol. 66, 211–241 (2015).

2. Li, W., Ruf, S. & Bock, R. Chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker for plastid transformation. Plant Mol. Biol. 76, 443–451 (2011).

3. Kazama, T. et al. Curing cytoplasmic male sterility via TALEN-mediatedmitochondrial ge nome editing. Nat. Plants 5, 722–730 (2019).

https://doi.org/10.1038/s41477-022-01108-y