用于细胞质递送和大分子药物可控释放的相分离多肽

撰文 | 张祎男

生物大分子，包括多肽、蛋白、RNA等，凭借高药效、特异性和安全性等关键优势，有望在各种疾病治疗中发挥重要作用。然而，由于较弱的细胞膜穿透性和核内体截留导致的胞内暴露受限，生物大分子的治疗潜力一直未得到充分发挥。因此，开发安全的载体将治疗药物递送到胞内一直深受关注。理想情况下，可对载体进行化学修饰，通过核内体逃逸实现治疗药物的释放。或者，使用非内吞进入机制的方法也可以提高给药效率。除此之外，需注意使药物的封装方式不影响其生物活性，载体的生物毒性也要达到可忽略不计的水平。为实现该目的，现在多采用无机纳米粒子、合成高分子等纳米材料作为药物载体，其它方式还包括，将大分子药物结合到细胞穿透性多肽来增强核内体逃逸效果。虽然这些方式具有潜力并在临床转化中受到重视，它们也存在诸多缺点。尤其是在制作工艺较为复杂，并经常需要使用有机试剂，可能对治疗药物生物活性造成破坏。针对无机或者脂质纳米粒子的安全性也存在担忧。

2022年2月3日，新加坡南洋理工大学Ali Miserez组在Nature Chemistry上发表了题为Phase-separating peptides for direct cytosolic delivery and redox-activated release of macromolecular therapeutics的研究论文。他们开发了一种pH和氧化还原响应的多肽团聚体微滴，实现了多种大分子药物的胞内递送和释放。

传统观念认为载体的尺寸需在200 nm以下才能穿过细胞膜，Ali Miserez组对该观念进行了挑战。他们发现通过液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）制备的微米级多肽团聚体可以通过一种不依赖内吞作用的途径穿过细胞膜，其中在多聚体内可以装载蛋白和低分子量化合物，这有望为治疗药物的胞内运输提供新的途径。这种多肽团聚体的灵感来源于自凝聚的富组氨酸喙蛋白（histidine(His)-rich beak proteins, HBPs），相比于传统纳米载体具有以下优势：（1）药物封装过程快（秒级）；（2）水基环境有利于保持药物活性；（3）载体毒性可忽略不计。除此之外，形成团聚体的条件可通过单个氨基酸突变进行精确调控。基于此，他们设计出一种pH和氧化还原响应的喙肽（HBpep）团聚体，该团聚体中有一段包括二硫键的自毁基团，可在胞内还原性环境中引发团聚体解聚实现药物释放。

为实现团聚的pH响应，他们在HBpep上特定位点插入赖氨酸残基（HBpep-K），将相分离发生的pH值从7.5提升到9.0。接下来，他们在插入的赖氨酸上修饰包含双硫键的基团（HBpep-SR），使相分离在pH 6.5时即可发生，此时多肽团聚形成稳定的微滴。在pH 6.5的自团聚过程中，HBpep-SR可以包裹大量的大分子药物，并不对药物分子的尺寸和电势产生影响。这种包含药物分子的团聚体在中性环境中保持稳定，直到被细胞内化。在胞内还原性环境中，双硫键会被还原，最终经历一系列自催化反应使赖氨酸上修饰基团消失, HBpep-SR转变为HBpep-K，微滴解聚实现药物释放。

作者首先采用EGFP蛋白研究了这种多肽团聚体的胞内递送效果，发现在4小时内，载有EGFP团聚体被肝癌细胞（HepG2）内化，在24小时内EGFP释放到细胞质中。而作为对照组的EGFP本身无法单独穿过细胞膜。采用其它细胞株的实验中也得到了类似的结果。作者发现，HBpep-SR团聚体在PBS缓冲液中几乎未释放EGFP，而当溶液含有具有还原性的GSH时，在24小时内EGFP释放达到90%，并且GSH的浓度时调控EGFP释放的唯一因素。由此作者认为共聚体的解聚是由GSH的还原作用激活的。

作者还研究了HBpep-SR团聚体所能装载的生物分子的分子量和等电点范围，发现该载体适用于不同分子量和等电点蛋白分子的递送，其中成功实现了分子量高达430 kDa的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）的胞内递送。此外，该方法还能有效地递送多肽和mRNA。在对HBpep-SR团聚体被细胞内化机制的研究中，作者发现内化过程对于多种常见的内吞作用抑制剂均不敏感。相反，该过程受到胆固醇去除剂甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD）的影响。这表明，HBpep-SR团聚体的内化看起来依赖脂质筏的调控。

该研究实现了包括蛋白质、多肽和mRNA等多种生物分子在不同细胞株中的胞内递送。通过采用二硫键之外的化学引发剂，有望进一步拓宽HBpep-SR的应用潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41557-021-00854-4

制版人：十一

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