一山也可容二虎，双分子共调节线粒体凋亡孔生长及线粒体DNA释放

撰文 | 咸姐

责编 | 兮

细胞凋亡是一种发生在生理环境中的程序性细胞死亡形式，对维持组织内环境稳态和胚胎发育必不可少。重要的是，凋亡过程的下调是肿瘤发生的主要原因，而该过程的上调则会诱发感染性、自身免疫性和神经退行性疾病。因此，控制细胞凋亡是治疗相关疾病的重要靶点【1】。

在脊椎动物中常见的内源性或线粒体凋亡途径受Bcl-2蛋白家族严格控制，并涉及线粒体外膜通透（MOMP），在MOMP之后，细胞色素c和SMAC/DIABLO等凋亡因子被释放到细胞质中，激活导致细胞死亡的caspase级联反应。几十年的深入研究发现了至少18个不同的Bcl-2家族成员，根据其在凋亡中的功能和包含的Bcl-2同源性（BH）结构域的数量可以将其分为三个亚组。其中一类Bcl-2家族的促凋亡成员是被认为是MOMP直接执行者的多BH结构域的BAX和BAK【1,2】。BAX和BAK是凋亡内在途径的核心，虽然两者都在细胞质和MOM之间穿梭，但BAX主要定位于健康细胞的细胞质，而BAK主要位于MOM。一旦被激活，这些蛋白质就会寡聚体化并介导MOMP【1】。已有研究发现，在模型膜中，BAX寡聚体以多种形式存在，大多数是基于二聚体单元。超分辨率成像显示BAX可组织成线状、弧形和环状，其中弧形和环状均能直接穿透脂质膜【3】。最近的研究还表明，在MOMP后，BAX和BAK能形成大型巨孔，释放大的大分子，如线粒体DNA（mtDNA）【4】，而一旦进入细胞质，mtDNA就可通过cGAS/STING信号通路触发炎症反应。毫无疑问，这些发现将BAX和BAK与细胞凋亡炎症结果的调节联系了起来。随着研究的深入，人们对BAX和BAK作为癌症治疗的药物靶点的兴趣与日俱增，但是，目前对它们之间分子机制的了解仍不足，这也是限制了相关小分子药物成功开发的重要原因。

2022年2月3日，来自德国蒂宾根大学的Ana J. Garcıá Saéz团队在Molecular Cell上在线发表题为The interplay between BAX and BAK tunes apoptotic pore growth to control mitochondrial-DNA-mediated inflammation 的文章，结合不同的单分子显微镜方法在纳米尺度上分析BAX和BAK的超分子结构，证实凋亡孔的生长速率和对线粒体DNA的容许性可以通过BAX和BAK分子之间相互调节彼此的组装的平衡而进行动态调控，从而影响下游的炎症信号。

为了在纳米尺度上可视化BAK的结构组织，本文研究人员使用了单分子定位显微技术（SMLM），证实了在健康细胞中BAK在线粒体网络上的均匀分布——通常在超分辨率图像中以单个分子排列在MOM上的形式出现；相反，在凋亡细胞中，BAK在线粒体碎片上重组成具有不同大分子结构的离散焦点（图1）。虽然大部分的信号以点和聚合物的形式出现，但大约40%的BAK集合与长度和半径相似的线、弧和环相对应，而且与细胞系无关。由此表明凋亡细胞中BAK簇的结构与BAX相似，但是BAK形成的组件更小，在相似条件下的尺寸也更均匀。

图1 左：健康细胞；右：凋亡细胞

随后，为了将SMLM在凋亡细胞中检测到的BAK纳米组装体与其形成膜孔的能力在功能上联系起来，研究人员从含有活性BAK的蛋白脂质体中制备了重组的全长单体BAK，并制备了负载型脂质双层膜（SLB），使用了原子力显微技术（AFM）进行观察。在AFM图像中，对照膜显得平坦光滑，但是含有活性BAK的SLB则呈现出从膜上突出的结构。值得注意的是，除了未被定义的聚集体外，这些结构还包括了线状、弧状和环状。更重要的是，AFM提供的膜表面的3D图像显示出与BAK环和弧相关的膜孔，而且与BAX孔相比，BAK孔更小且更均匀。由此也证实了SMLM数据的结果。

既然BAX和BAK组装在膜中形成的结构的大小如此不同，那么它们是否表现出不同的寡聚特性呢？研究人员通过TIRF单分子成像比较了不同浓度的膜结合BAX和BAK寡聚物的体外化学计量，结果显示与BAX相比，BAK在膜中的寡聚倾向更低，这与AFM观察到的较小结构的形成一致；此外，BAX的寡聚程度与膜密度密切相关，而BAK的寡聚程度则与此无关。随后，研究人员设计了一种方法来量化凋亡细胞线粒体中BAX和BAK寡聚的实时动力学，从而可以估计它们随时间的化学计量比。结果显示BAX和BAK在细胞凋亡中激活时的组装在机制上是不同的，具有不同的寡聚特性。

BAX和BAK可以共定位于凋亡位点，但是它们又呈现不同的寡聚特性，那么这背后的机制是怎样的呢？这是否可能在细胞凋亡过程中产生功能性后果呢？研究人员首先发现，BAX和BAK可以相互影响，相互促进彼此的组装——BAX 促使BAK凋亡结构的大小增加，而BAK加速了BAX的组装动力学。进一步地利用Snap-BAX和Halo-BAK的双色超分辨率STED显微镜，并结合4xmt-mTurquoise2标记的线粒体网络的共聚焦显微镜，研究人员揭示了BAX和BAK可共同组装成相同的超分子结构。深入研究还表明，BAK可通过直接招募和激活胞质BAX来加速BAX聚集的生长。随后，研究人员利用相关的活细胞共聚焦和固定细胞的airyscan超分辨率显微技术，以跟踪单细胞中与MOMP起始相关的mtDNA释放动力学。结果显示，与BAK增加的组装动力学一致，BAK加速了mtDNA的释放动力学，由此表明BAX和BAK的组装速率是mtDNA释放动力学的主要决定因素，BAX和BAK的协同组装调节了凋亡孔的生长速率及其对大分子（尤其是线粒体DNA）的容许性。进一步实验还证实BAX和BAK的相互作用可调节cGAS/STING通路和CD4+ T辅助细胞激活。

综上所述，本文首次报道了BAX和BAK在mtDNA定时释放中的功能，从而调节mtDNA介导的细胞凋亡中的炎症反应（图2）。证明了BAX和BAK分子之间的平衡决定了MOMP时线粒体内容物的相对释放动力学，而这一功能的机制基础来自于BAX和BAK不同的寡聚动力学，以及它们共同组装成超分子结构时的相互调控，从而共同决定了由此产生的凋亡孔的生长速率，影响凋亡时的下游炎症信号。

图2

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.01.008

制版人：十一

参考文献

1. Cosentino, K., and Garcı´a-Sa´ ez, A.J. (2017). BAX and BAK pores: are we closing the circle? Trends Cell Biol 27, 266–275.

2. Czabotar, P.E., Lessene, G., Strasser, A., and Adams, J.M. (2014). Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 49–63.

3. Salvador-Gallego, R., Mund, M., Cosentino, K. et al. (2016). Bax assembly into rings and arcs in apoptotic mitochondria is linked to membrane pores. EMBO J 35, 389–401.

4. Mcarthur, K., Whitehead, L.W., Heddleston, J.M. et al. (2018). BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis. Science 359, eaao6047.

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