《食品科学》：抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定

呋喃唑酮，又名痢特灵，是一种常见的硝基呋喃类药物，因其抗菌谱较宽且制备简单，常用于防治由多种致病菌引起的肠道感染、溃疡病等，也常作为畜禽类和水产动物的生长促进剂。研究证明呋喃唑酮属于强致癌物，对人体健康会造成很大威胁，目前包括中国在内的许多国家都已明确禁止其在食品性动物中使用。但是受经济利益驱使，我国非法使用的现象仍很严重，因此加强对动物性食品中呋喃唑酮的检测监控十分必要。

江西农业大学食品科学与工程学院，南昌市农产品加工与质量控制重点实验室的陈薪竹、杜华英*、杨武英*等人首先从前期获得的抗AOZ衍生物单克隆抗体阳性杂交瘤细胞1D2出发，采用重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）技术，用连接肽(G4S)3将抗体VH、VL基因连接构建完整的scFv基因，然后对其编码的氨基酸进行生物信息学分析，再把抗AOZ衍生物scFv基因转入到可溶性表达载体plip6/GN中和碱性磷酸酶（AP）基因进行融合表达，最后采用直接竞争酶联免疫分析法（dcELISA）对该抗体进行活性检测，旨在为后续AOZ残留检测免疫分析方法的建立以及抗体的分子修饰、改造奠定一定的实验基础。

1、抗AOZ衍生物scFv基因构建

以抗AOZ衍生物单克隆抗体阳性杂交瘤细胞1D2为出发点，提取细胞总RNA后，其电泳图条带清晰（图1A），两条带分别为28S、18S，且28S约为18S的2 倍，经核酸蛋白分析仪测定，RNA质量浓度为145.206 ng/mL，A 260 nm /A 280 nm 和A 260 nm /A 230 nm 比值分别为1.94、1.78，纯度较高，适用于后续反转录PCR扩增抗体V H 、V L 基因。如图1B所示，以RNA为模板，采用V H For、V H Rev或V L For、V L Rev引物进行PCR扩增，分别得到了大小约为350 bp的V H 、V L 片段，通过SOE-PCR扩增后，连接肽(G 4 S) 3 将V H 、V L 基因片段连接，得到一条大小为750 bp的条带，符合预期判断。

2、抗AOZ衍生物scFv基因鉴定

采用V H For SfiI、VL Rev NotI引物对重组子进行PCR鉴定，得到了750 bp左右的scFv基因片段（图2A）。酶切鉴定所用酶为BglI，Plip6/GN空载体上有3 个BglI酶切位点，经BglI酶切后有2 条2 000 bp左右和1 条3 000 bp左右的条带，插入目的片段后的载体经BglI酶切后有1 条2 000 bp左右和2 条3 000 bp左右的条带，由图2B酶切鉴定结果可知酶切结果正确，而且根据对测序结果的分析可知（图3），抗AOZ衍生物单克隆抗体的VH和VL基因大小分别为360 bp和345 bp，抗体V H 和V L 基因已由大小为45 bp的Linker连接在一起，形成了正确的抗AOZ衍生物scFv基因结构。

3、抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列推导

如图4所示，抗AOZ衍生物scFv全长750 bp，编码250 个氨基酸，其中V H 编码120 个氨基酸，V L 编码115 个氨基酸。推导出的氨基酸序列经V-QUEST程序分析后，V H 、V L 序列被划分为4 个FR区和3 个CDR区。经NCBI数据库比对后发现scFv V H 与序列号为ATI97769.1的鼠源抗体重链可变区高度同源（83.33%），V L 与序列号为BAC56972.1的鼠源抗体轻链可变区高度同源（90.43%）。经比对发现，该scFv V H 、V L 与2 个高度同源序列主要是在CDR1和CDR3区有较大差异，而且CDR3区的差异最大，这说明在scFv的制备中这2 个区域的氨基酸组成可能对抗原识别作用最为关键。

4、抗AOZ衍生物scFv物理化学性质分析

根据表2可知，其中丝氨酸含量最高，占13.6%；其次分别为甘氨酸（12.8%）、苏氨酸（9.6%）、亮氨酸（9.2%）、酪氨酸（6.8%）；半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸含量最低，占比分别为1.6%、1.2%、0.8%。该抗体分子式为C 1192 H 1854 N 324 O 379 S 7 ，相对分子质量为27 012.20，理论pI值为9.13，属于碱性氨基酸。

5、抗AOZ衍生物scFv蛋白的二、三级结构分析

通过SWISS-MODEL子程序进行同源模建后得到抗AOZ衍生物scFv的三维结构图（图5），观察抗体模型正面俯视图（图5A）发现，抗AOZ衍生物scFv的V H 、V L 由连接肽相连，6 个CDR区的分布形成一个“环桶状”结构；从图5B抗体侧面图则可看出，与抗原结合的互补决定区为空穴似的“口袋状”，这符合典型scFv的空间结构，与理论上抗原结合位点的空间构象相符，理论上应该具有良好的抗原结合活性。

6、抗AOZ衍生物scFv活性鉴定

SDS-PAGE结果如图6A所示，与plip6/GN/BL21（DE3）空载体对照菌相比，plip6/GN-scFv-phoA/BL21（DE3）工程菌在分子质量55～72 kDa处出现一条新生蛋白带，该条带就是抗AOZ衍生物scFv抗体蛋白。采用dcELISA对该抗体进行活性检测，以抗体稀释倍数为横坐标，其对应A 405 nm 值为纵坐标作图，由图6B可得，抗体稀释倍数越大，其效价列对应的A 405 nm 值越小，由此说明scFv抗体能够识别包被抗原，还可以看出添加药物的抑制作用分析对应的A 405 nm 值均比未加药物的效价测定对应的A 405 nm 值小，说明药物2-NP-AOZ对抗原抗体的特异性结合产生抑制，得到的重组scFv具有活性。

结 论

本研究从分泌产生抗AOZ衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞中成功克隆获得了抗AOZ衍生物抗体的VH、VL基因，并通过SOE-PCR用连接肽(G4S)3将VH、VL基因按VH-Linker-VL形式连接，成功构建了抗AOZ衍生物scFv基因。通过分析scFv基因测序结果并对其氨基酸序列进行推导可知，scFv基因全长750 bp，其中，VH长360 bp，编码120 个氨基酸，VL长345 bp，编码115 个氨基酸，连接肽(G4S)3大小为45 bp。该抗体相对分子质量为27 012.20，理论pI值为9.13，属于碱性氨基酸。抗体二级、三级结构的预测结果表明该抗体符合典型scFv的空间结构，并且dcELISA结果也再次确认该抗体能与抗原稳定结合和特异性识别包被抗原。本研究抗AOZ衍生物scFv基因的成功构建和抗体蛋白结构预测为后续抗体蛋白纯化和动物性食品中AOZ残留检测免疫分析方法的建立奠定了一定的实验基础，也为在分子水平上对该抗体进行改造提供了一定的依据。

本文《抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定》来源于《食品科学》2021年42卷24期67-73页，作者：陈薪竹，王玉波，王丹，洪艳平，杜华英，戴棚，邓炜杰，熊建华，杨武英。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201015-134。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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