手把手教你Western blot内参蛋白的选择

在western blot（WB）实验中内参蛋白是非常重要且必须的一部分，内参蛋白通常是由细胞中管家基因编码的蛋白，内参保证了每个泳道中蛋白上样量相同，不同泳道上的蛋白以相同的效率从凝胶转到膜上，不同泳道上抗体孵育（包括一抗和二抗）、信号检测都是一致的，是量化目的蛋白相对表达量的重要标尺。

插叙：前期我们有推送过蛋白印迹相关SCI期刊提出的要求（ 点击下文阅读 ）

1. 理想的内参蛋白需满足的条件

理想的内参蛋白应满足以下条件：

（1）高度或中度表达，排除太高或低表达；

（2）在测试条件下内参蛋白水平要保持恒定（与总蛋白量相比），例如，用特定药物处理或未经特定药物处理、正常细胞和癌细胞、细胞周期以及细胞是否活化、内源性或外源性因素等；

（3）内参蛋白和目的蛋白相对分子量有差异，内参和目标蛋白的检测限都在动态范围内，可在信号不饱和的情况下揭示内参和目标蛋白量的变化。

2. 哺乳动物细胞中常用的内参

全细胞或细胞浆中：GAPDH、β-Actin、β-Tubulin、Vinculin等；

细胞核中：Lamin B1、TBP、HDAC、PCNA、Histone H3等；

线粒体中：HSP60、COX IV等。

（1） GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在糖酵解过程中将3-磷酸甘油醛进一步磷酸化的一个酶，其编码基因属于管家基因，广泛表达于各种细胞组织中，且表达相对稳定，故常常用来作为western blot的内参。GAPDH会随着组织老化，表达水平发生变化，因此不适合在年龄差别很大的组织样本中作上样内参；缺氧时GAPDH聚集，表达上调，因此不能在涉及氧气的相关研究中作为内参；此外，GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，故在研究肿瘤代谢过程时应慎用。

（2） β-Actin：β肌动蛋白，一种非肌型肌动蛋白，也是一类常见的管家基因编码的蛋白质，主要功能是组成细胞的骨架。在各种组织中广泛表达，表达水平相对恒定。但在胞质分裂、内吞或应激等进程中，细胞骨架重组信号刺激纤丝状肌动蛋白的片段化和解聚；在原发性乳腺癌细胞中，肌动蛋白被高度磷酸化；在凋亡条件下，心肌和骨骼肌中均能观察到β-Actin的清除，因此，在相关研究中需要谨慎选择。

（3） β-Tubulin：是Tubulin（微管蛋白）家族中的一员，微管蛋白在物种间高度保守，不同亚型的微管蛋白也有显著的同源性。β-Tubulin是一类重要的管家基因编码的蛋白，在细胞周期过程中扮演重要角色，广泛用于作为WB内参。微管蛋白是多种药物的作用靶点，如抗癌药物紫杉醇、长春碱和长春新碱，抗痛风药物秋水仙碱和抗真菌药物灰黄霉素，因此有这些药物作用时，内参勿选Tubulin。

（4） Lamin B1：核纤层蛋白B1，核纤层蛋白是一种核膜结构组分，用于支撑核被膜并参与细胞周期中核被膜的解体和再形成，对维持正常的细胞功能（如细胞周期控制、DNA复制）非常重要。Lamin B1在物种间高度保守，常用于有核被膜的样品作为内参。在细胞凋亡时，Lamin B1可被caspase剪切，另外，核纤层细胞B1基因LMNB1的复制与神经系统疾病，成年期发病脑白质营养不良的发病机制相关，在相关研究中应予以注意。

总之，选择内参主要考虑以下方面：

（1）样本种属来源，哺乳动物的组织或者细胞样本，植物、昆虫等来源样本，适用的内参各不相同；

（2）目的蛋白分子量，通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上，此外，不同公司、同一公司不同货号的抗体相对分子量大小也会有些差异；

（3）目的蛋白表达部位，全细胞和胞浆蛋白、胞核蛋白、核膜蛋白、线粒体蛋白等都有对应的内参蛋白供选择；

（4）实际的实验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高；在凋亡实验时，Lamin B1等不适合作为内参；在加入抗癌和抗真菌药物时，β-Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参；（5）组织特异性，不同内参蛋白在不同组织中的表达可能不一样，因此不同的组织应选择不同的内参。

这里再放一张之前群友提供的内参选择图，建议收藏~

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