中科院团队从葡萄籽中发现天然类黄酮原花青素C1具有抗衰老活性，可延长小鼠寿命64.2%

衰老是包括心血管疾病、代谢性疾病、神经退行性病理和各种恶性肿瘤在内的慢性疾病的最大风险因素之一。衰老相关的器官功能衰退和与年龄相关的慢性疾病风险增加，部分是由衰老细胞的积累驱动的。

近年来，细胞衰老受到了广泛的关注，因为它被发现是一种可被药物靶向的过程。目前来看，通过抗衰老治疗可以预防或延迟多种衰老相关疾病。

近日，Nature Metabolism 杂志在线发表了中科院孙宇团队发表的研究论文The flavonoid procyanidin C1 has senotherapeutic activity and increases lifespan in mice。该文章发现类黄酮原花青素 C1 具有抗衰老活性并可显著延长小鼠健康寿命和平均寿命 [1] 。

低浓度葡萄籽萃取物（GSE）可以抑制衰老相关的分泌表型（SASP）

为了寻找能有效调节衰老细胞的新化合物，研究者利用由 46 种植物源性药物组成的植物化学文库（PDMA 文库）进行了无偏倚筛选。

在该研究中，研究人员用博莱霉素诱导人类原代前列腺间质细胞系 PSC27 进入衰老状态并呈现出一种典型的表型，即 SASP。基于衰老 PSC27 细胞进行的 PDMA 文库大规模筛选，鉴定出了几种具有选择性杀伤衰老细胞潜力的化合物，包括 GSE，槲皮素，非瑟素，姜黄素和胡椒龙胺。

因既往关于 GSE 的研究较少，研究人员随后对其进行了进一步研究。他们发现在体外条件下，GSE 可以使 SASP 分子标记的表达降低，并且发现 p65 的核易位在低浓度（如 0.1875μgml−1）时可以被 GSE 拮抗，在 GSE 浓度较高时反而出现增强，可能是细胞凋亡造成的一种炎性表型。这些数据说明，在不同浓度 GSE 处理条件下，衰老细胞的反应不同。进一步生信分析发现，GSE 在特定浓度范围内具有控制衰老细胞促炎性表型的作用。

GSE 在高浓度时具有抗衰老效应

研究人员进一步探索了高浓度 GSE 对衰老细胞的杀伤作用。SA-β-Gal 染色结果表明，在 0.75μgml−1 的 GSE 浓度下，衰老细胞开始被清除；在 3.75μgml−1 浓度时，衰老细胞存活率降低至 20% 的极限平台阶段。

重要的是，即使在高浓度条件下，GSE 对增殖细胞也几乎不产生杀伤作用。机制方面研究显示，GSE 对衰老细胞的杀伤作用主要是通过诱导凋亡、促进线粒体氧化应激而实现。

GSE 中的类黄酮原花青素 C1（PCC1）具有抗衰老细胞作用

接下来，研究人员利用 HPLC 及 QTOF-MS 技术对 GSE 的成分进行分析，发现了三种主要的植物化学物质：包括酚酸、类黄酮（如黄烷-3-醇、原花青素）和其它化合物。其中，少数成分被鉴定为原花青素及其衍生物，这些物质在以往的研究中被发现可以靶向线粒体蛋白并缓解多种人类慢性疾病。

（来源：Pixabay）

HPLC-QTOF-MS 的初步分析表明，GSE 在特定的质谱峰处的谱图与 PCC1 的谱图相互匹配。PCC1 既往被证明可以诱导 DNA 损伤、导致细胞周期阻滞和检查点激酶表达增加，并且可能通过诱导凋亡发挥抗肿瘤效应。研究人员推测：PCC1 是否在靶向诱导衰老细胞凋亡方面具有某种优势呢？因此，他们对 PCC1 的选择性抗衰老能力开展了一系列深入研究。

数据表明，PCC1 在体外浓度为 50μM 时开始对衰老基质细胞具有抗衰老作用，直到 PCC1 浓度增加至 200μM 对衰老细胞的杀伤作用达到平台期时，增殖细胞也基本不受影响。

只有当 PCC1 浓度为 600μM 或更高时，才对对照组，即正常细胞产生毒性作用。这说明 PCC1 以剂量依赖性的方式选择性清除衰老的人基质细胞，但在适当的浓度下对未衰老的细胞却无显著作用。并且研究者们还在人类胎儿肺成纤维细胞（WI38）、原始人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人类间充质干细胞（MSC）的衰老细胞中对 PCC1 的选择性抗衰老能力进行了扩大验证，基本重复了之前在 PSC27 细胞中发现的现象。

进一步研究发现，泛半胱天冬氨酸酶凋亡抑制剂 QVD-OPh 可以明显逆转 PCC1 的抗衰老作用，而铁死亡、焦亡或坏死相关的抑制剂分析却对 PCC1 的作用没有影响，这说明 PCC1 主要是通过诱导凋亡来发挥抗衰老作用的。对 GSE 中的其它组分进行研究时，在 PCC1 的剂量范围内，大多数 GSE 成分没有表现出抗衰老作用。这些结果说明，PCC1 是 GSE 抗衰老作用的主要成分。

PCC1 引起衰老细胞线粒体功能障碍

在化学本质上 PCC1 属于类黄酮超家族，可以清除自由基、螯合金属离子、减少过氧化氢的形成，其抗氧化性能归因于结构中的“-OH”基团及其在类黄酮分子环上的位置。为了探索 PCC1 的作用机制，研究人员首先分析了 PCC1 对衰老细胞全转录组表达的影响。

GSEA 谱显示 SASP 和 NF-κB 通路均被 PCC1 显著抑制，其中表达差异最显著的是一些分泌因子。逆向实验显示 PCC1 可以部分通过促凋亡分子 NOXA 和 PUMA 来介导衰老细胞的凋亡。因为在哺乳动物细胞中，原花青素通常可以增加细胞活力，减少 ROS 的产生，并抑制氧化应激。

接下来，研究人员想知道是否可以在暴露于 PCC1 的衰老细胞中观察到类似的抗氧化作用。令人惊讶的是，研究结果与预期恰恰相反，当使用 PCC1 处理时，衰老的 PSC27 细胞显示出更高的 ROS 水平，而 HS-1793（一种稳定的白藜芦醇类似物，具有自由基清除活性）可以有效地阻止 PCC1 治疗的衰老细胞中 ROS 的产生。

然而，在 PCC1 处理过的衰老细胞暴露于 CCCP（一种原载体线粒体非偶联剂）或ruxotemitide（LTX-315）（一种诱导线粒体外膜渗透的两亲性阳离子肽）后，ROS 水平进一步升高。尽管使用 CCCP 或 Ruxotemtide 本身也会引起 ROS 产生的增强，但其效果弱于 PCC1，提示 PCC1 可以引起衰老细胞线粒体功能障碍。研究同时显示，PCC1 治疗促进了细胞色素c从线粒体释放到周围细胞质空间，而这一过程通常直接驱动凋亡的发生。

p53 作为一种调控细胞命运的因子，既可以通过转录激活促凋亡基因诱导细胞凋亡，也可以通过转位到线粒体以一种转录非依赖的方式诱导细胞凋亡。研究人员发现，细胞衰老时 p53 核易位明显增加，而 PCC1 可以减少 p53 核易位。由于 p53 的核排出是诱导衰老细胞凋亡的关键步骤，研究人员进一步评估了 PCC1 对 p53 分布的影响。

结果显示在 pcc1 处理的衰老细胞中，细胞核中 p53 水平降低，但线粒体中 p53 水平升高，说明 p53 由细胞核向线粒体基质的移位增强。同时，研究人员还发现PCC1处理后，线粒体膜电位(Δψm)在衰老细胞中显著减少，而Δψm下降可以通过线粒体介导的内在途径触发细胞凋亡。这说明 PCC1 可以促进 ROS 的产生，触发细胞色素 c 的释放，并导致衰老细胞 Δψm 紊乱，最终导致线粒体功能失调、驱动细胞凋亡。

以上结果表明，PCC1 一方面通过上调促凋亡因子 NOXA 和 PUMA，另一方面通过活性氧生成增强和线粒体功能障碍来介导衰老细胞发生凋亡。

PCC1 促进肿瘤消退，减少化疗耐药性

在临床中，耐药限制了大多数抗癌治疗的疗效，而衰老细胞往往通过在药物损伤的肿瘤微环境中形成 SASP 表型而导致治疗耐药的发生。因而研究人员进一步探索 PCC1 是否可以通过减少原发肿瘤病灶中的衰老细胞来提高抗癌治疗效果。

首先，研究人员将 PC3 前列腺癌细胞和原始 PSC27 基质细胞混合接种到小鼠体内，发现衰老细胞可以促进前列腺癌的生长。通过给药实验发现，尽管 PCC1 单独给药不能使肿瘤体积缩小，但是其与化疗药物米托蒽醌（MIT）联合应用时，较 MIT 单药治疗的效果明显增加。

对给药后的肿瘤进行免疫组化和转录测序分析发现，MIT 治疗可以明显使肿瘤中的基质细胞发生衰老性变化，主要表现为 SASP 因子和衰老标记分子 p16INK4a 的升高，而联合 PCC1 治疗后，这些衰老性变化则可以被明显逆转。

并且 PCC1 联合 MIT 治疗时，肿瘤细胞的 DNA 损伤和细胞凋亡显著增强，这说明 PCC1 可以增强 MIT 的细胞毒性。生存研究表明，PCC1 单独治疗仅能略微延长生存期，而接受 MIT-PCC1 联合治疗的小鼠中位生存期最长，存活时间比单独接受 MIT 治疗的小鼠延长了 48.1%。

另外值得注意的是，PCC1 的治疗并没有对小鼠的肝肾功能、免疫系统或其它关键器官造成明显的损伤，这说明 PCC1 联合常规化疗有可能增强肿瘤反应而不引起严重的全身毒性。

以上数据表明，尽管单独使用 PCC1 既不能抑制肿瘤生长也不能促进动物生存，但PCC1 与 MIT 联合却可以显著增强化疗效果，而不引起额外的毒副作用。

PCC1 可以缓解身体功能障碍

既往研究显示，即使少量的衰老细胞也能引起幼小动物的身体机能障碍。那么 PCC1 是否可以在体内选择性地杀死衰老细胞，从而预防机体功能障碍？

为了回答这个问题，研究人员利用带荧光素酶（Luc+）的对照和衰老小鼠胚胎成纤维细胞分别构建皮下移植瘤模型，并给予 PCC1 治疗。

结果显示，对植入衰老细胞的小鼠进行 PCC1 治疗后，荧光信号强度显著降低，而植入 LUC+ 对照细胞的小鼠的荧光信号强度没有明显改变，说明 PCC1 在小鼠体内具有选择性抗衰老作用。将衰老细胞植入后的幼鼠用 PCC1 治疗 1 周，可防止小鼠最大行走速度（RotaRod test）、吊挂耐力（吊挂试验）和握力（握力米）的下降，同时还可以预防幼鼠出现生理功能障碍。

图 | PCC1 和 MIT 联合治疗可以明显增强肿瘤对抗癌治疗的敏感性（图片来源：Nature Metabolism）

接下来，研究者评估消除衰老细胞对中年动物的益处。为此，研究人员在 17 月龄的 C57BL/6J 小鼠中分别植入对照和衰老的 MEFs。

结果显示，携带衰老细胞但只接受对照治疗的动物存活明显低于接受 PCC1 治疗组（死亡风险高出 2.4 倍）。但是两组小鼠之间死亡相关的疾病、肿瘤负担等没有显著差异。这说明衰老细胞造成的负担可以导致中年小鼠身体功能障碍、死亡率增加，但通过服用 PCC1 这种抗衰剂可以降低这些风险。

接着研究人员又选择了两种独立的体内衰老动物模型来验证 PCC1 的治疗效果。值得注意的是，经历了全身放疗（WBI）的动物表现出异常的身体外观，包括明显的灰白毛发，而 PCC1 在很大程度上逆转了这一表型。同时 PCC1 治疗后小鼠的最大步行速度、吊挂耐力、握力、跑步机耐力、日常活动和平衡性能都得到了改善。

解剖结果显示，PCC1 治疗后的小鼠心脏、肺、肾脏等组织中 SA-β- gal 阳性衰老细胞的百分比、衰老标志物和关键 SASP 也明显降低。

此外，研究人员还对老年小鼠（24-27 个月的小鼠，大致相当于 75-90 岁的人类）给予了 PCC1 治疗。结果显示，PCC1 治疗组的中位生存时间延长了 64.2%（或总寿命延长 9.4%），而死亡率风险降低 65.0%。这些数据表明 PCC1 可以显著降低老年小鼠的年龄相关性死亡风险，但对小鼠生理机能并不造成明显的负面影响。

总体而言，中科院孙宇团队的这项研究发现了 GSE 中的提取物 PCC1 可以减轻衰老负担和其它可能发展成促炎表型的细胞，促进衰老细胞凋亡。同时在不引起小鼠发病率升高的情况下增加小鼠寿命。并且即使在老年动物中使用，PCC1 在延缓衰老相关功能障碍、减少衰老相关疾病和改善健康状况方面仍具有十分突出的潜力，从而为未来老年医学提高健康寿命和生存时间提供了新的希望。

-End-

参考：

1、Xu, Q., Fu, Q., Li, Z. et al. The flavonoid procyanidin C1 has senotherapeutic activity and increases lifespan in mice. Nat Metab 3, 1706–1726 (2021). https://doi.org/10.1038/s42255-021-00491-8