纳米孔直接测序蛋白质，精度高达100%，还可识别氨基酸修饰

撰文 | 王聪

蛋白质是构成生物体的主要成分，同时也是生命活动的主要承担者。具有生物学功能的蛋白质往往具有特定的空间结构，而蛋白质结构在多个层级上被定义，其中一级结构，即氨基酸的种类和排列，最为重要，它可以决定蛋白质的高级结构。

但一直以来，想要直接读取蛋白质的一级结构是十分困难的，在大多数情况下，科学家们会根据基因序列和氨基酸密码子表来“破译”蛋白质的氨基酸序列。然而，由于转录后修饰和翻译后修饰的存在，破译结果并非完全正确，甚至与真实的氨基酸序列有很大差异。

2021年11月4日，荷兰代尔夫特理工大学的研究人员在 Science 期刊上发表了题为：Multiple rereads of single proteins at single–amino acid resolution using nanopores（利用纳米孔在单氨基酸分辨率下对单蛋白质进行多次重读）的研究论文。

该研究利用纳米孔测序技术成功扫描并读取单个蛋白质的氨基酸序列：线性化的DNA-肽复合物缓慢通过一个微小的纳米孔，根据电流的变化和强度，研究人员就能读取相关的蛋白质信息内容，直接对蛋白质的氨基酸序列进行测序。

蛋白质是生命活动的主要承担者。事实上，所有生物的蛋白质都是由大约20种不同的氨基酸组成的长肽链，就像项链上有不同种类的珠子一样。遗憾的是，目前的蛋白质测序方法价格昂贵，而且不能检测许多稀有蛋白质。

近年来发展起来的纳米孔测序技术，已经能够直接扫描和排序单个DNA分子。如今，这篇发表在 Science 上的研究表明，我们完全可以以类似于DNA纳米孔测序的方式直接读取蛋白质的氨基酸序列。

本研究的通讯作者 Cees Dekker 教授表示：在过去的30年里，基于纳米孔的DNA测序已经从一个想法发展成为一个实际的工作设备，并成功开发了商业化的便携式纳米孔测序仪，服务于价值数十亿美元的基因组测序市场。在我们的论文中，我们将纳米孔的概念扩展到单个蛋白质的读取。这可能会对基础蛋白质研究和医学诊断产生重大影响。

牛津纳米孔开发的纳米孔基因测序仪

直接读取氨基酸序列

对于如何利用纳米孔读取肽链中的单个氨基酸的特征，这篇论文的第一作者 Henry Brinkerhoff 博士打了一个形象的比喻：“想象一下，一个肽链中的氨基酸链就像一条项链，上面有不同大小的珠子。然后，你打开水龙头，慢慢地把项链送入下水道，也就是纳米孔。如果在某个时间点是一颗大珠子，它会堵塞下水道，那里面的水也就成了涓涓细流。相反，如果是一颗小珠子，那么下水道剩余的空隙就会比较大，水流也更大。”

用纳米孔肽阅读器直接读取氨基酸序列

因此，通过这项技术，研究人员可以非常精确地测量纳米孔的电流大小，并以此推测相应的氨基酸种类。更关键的是，这个过程并不会影响肽链的完整性，因此我们能够一次又一次地读取单个肽链，然后对所有数据进行拟合，从而以基本上100%的准确率获得肽链的序列组成。

解旋酶（红色）拖动连接了多肽（紫色）的 DNA 分子（黄色），使其缓慢通过纳米孔（绿色），从而通过读取电信号（橙色高亮）表征多肽的氨基酸序列。

条形码般的识别精度

为了进一步验证这项技术的准确性，研究人员改变了肽链的某个氨基酸，然后能够检测到显著差异的电信号，表明该技术是极其灵敏的。

事实上，这项新技术在识别单个蛋白质和绘制它们之间的细微变化方面非常强大，打个形象的比方——就像超市的收银员通过扫描条形码来识别每个产品一样。这也可能为未来的蛋白质从头测序提供新的途径。

纳米孔肽阅读器可以区分单氨基酸替代的单肽

Henry Brinkerhoff 博士表示：这项方法可能为未来蛋白质测序奠定基础，但就目前来说，蛋白的从头测序仍然是一个巨大的挑战。我们仍然需要大量描述来自不同序列的电信号，以便创建一个对应电信号和蛋白质序列的“密码表”。但即便如此，该研究已经能够成功分辨蛋白质序列中的单个氨基酸的改变，这无疑是一项重大进步，也将产生许多直接应用。

看见生物学的“暗物质”

暗物质，是理论上提出的可能存在于宇宙中的一种不可见的物质，它可能是宇宙物质的主要组成部分，但又不属于构成可见天体的任何一种已知的物质。

在细胞中，存在许多不可知的“暗物质”——翻译后修饰导致的数百万种蛋白质变异。这些蛋白质变异无法通过基因序列进行预测，但纳米孔蛋白测序技术的出现扭转了这一情况，利用目前的纳米孔肽阅读器，研究人员可以直接观测这些“生物学中的暗物质”。

反复读取单个蛋白以提高准确率

为了方便理解，通讯作者 Cees Dekker 教授打了一个比喻：项链上的珠子并不只是大小不同，还可能颜色不同，比如一些红色的珠子上代表附着一个磷酸基，另一些蓝色的珠子上代表附着一个糖基。这些变化对蛋白质功能至关重要，同时也是癌症等疾病的标志。我们的新方法将能够检测到这些变化，从而为癌症等疾病的检测和治疗提供新的理论依据。

结语

总而言之，这种能够直接读取蛋白质序列的蛋白质组学工具对于细胞生物学的研究和应用具有重要意义。该研究展示了一种基于纳米孔的单分子肽阅读器，它利用DNA解旋酶Hel308将DNA-肽结合物通过生物纳米孔MspA，根据电流变化读取线性化蛋白质的氨基酸序列。更重要的是，这种方法可以区分单个氨基酸的变化，具有高保真度和高通量潜力。这种单分子肽阅读器标志着蛋白质鉴定的新突破，并为单细胞内的单分子蛋白质测序和分类开辟了道路。

论文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381