做了 5 年的 MTT 实验 ,耗费了上万块 96 孔板。有成功的喜悦,有失败的沮丧,有好多话要对各位实验同仁说。在这之前,我们先回顾一下 MTT 的原理及操作步骤。
实验原理
MTT 是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下,生成蓝色的 formazan 结晶。
formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将 MTT 还原,无法形成结晶),且该结晶溶解于 DMSO。
利用酶标仪测定波长 490 nm 处的光密度 OD 值,以反映出活细胞数目。
实验步骤
1.接种细胞:用含 10% 胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔合适的细胞数量接种到 96 孔板,每孔体积 180 ul。
2.培养细胞:同一般培养条件,可根据试验目的和要求决定培养时间。
3.呈色:每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 缓冲液 pH=7.4 配制)20 ul。继续孵育 4 小时,终止培养,小心弃去孔内培养上清液,对于悬浮细胞,需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO,振荡 10 分钟,使结晶物充分融解。
4.比色:选择 490 nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。
个人心得体会
1. 细胞消化、接种数量:注意消化和数量,消化和数量,消化和数量(重要的事情说三遍)。从我个人的实验经验来看,这是重中之重。
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