裂谷热病毒的入侵因子——Lrp1

撰文 | 望夜

责编 | 兮

由新发突发病毒引起的传染病近年来接连暴发，如2014-2015年的埃博拉疫情、2015-2016年的寨卡流行及目前仍在全球大范围流行的新冠疫情，一再提醒认识和理解病毒感染致病机制的重要性。为有效防控传染病，世卫组织于2018年公布10种需优先研究的烈性病毒病【1】，裂谷热（Rift Valley fever，RFV）就位列其中。

裂谷热病毒（RVFV）是一种由蚊子传播的负链RNA病毒，隶属白蛉病毒科（Bunyaviridae）。RVFV的分布范围包括非洲大陆的大部分地区、马达加斯加岛及阿拉伯半岛；而可传播该病毒的蚊子在北美、欧洲均有发现，提示存在潜在扩散风险。RVFV可引起家畜（如绵羊、牛类）出现急性症状，并通过蚊子叮咬由动物传播至人，引发肝炎、出血热、脑炎、视网膜血管炎等症状【2】。目前尚无预防性疫苗和特效药物获批上市。

裂谷热病毒的基因组分成大（L）、中（M）、小（S）三个节段，其中L节段编码病毒聚合酶RdRp，M片段编码病毒糖蛋白前体GPC及非结构蛋白NSm，S节段编码核衣壳蛋白N及非结构蛋白NSs。GPC翻译后经蛋白酶切产生Gn和Gc，Gn形成囊膜表面的刺突，Gc为II型融合蛋白，两者共同介导病毒对宿主细胞的入侵和融合过程，并构成病毒粒子表面的正二十面体结构。

裂谷热病毒可感染多种细胞类型。文献已报道多种宿主因子参与RVFV入侵过程，如凝集素类分子DC-SIGN【3】、硫酸肝素【4】等，但研究表明上述分子更可能是病毒的粘附因子（attachment factor），RVFV入侵宿主真正的受体尚有待发现。

2021年9月21日，美国华盛顿大学（圣路易斯）医学院的Gaya K. Amarasinghe课题组与匹斯堡大学的Amy L. Hartman课题组合作在Cell上发表了文章Lrp1 is a host entry factor for Rift Valley fever virus，通过无偏的全基因组CRISPR/Cas9筛选出细胞表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Lrp1，low-density lipoprotein receptor-related protein 1）。Lrp1可以直接结合RVFV的Gn蛋白，其配体或抗体可有效阻断RVFV感染易感细胞，Lrp1配体mRAPD3可保护小鼠免受致病毒株感染引起的发病和死亡，因此认为Lrp1是裂谷热病毒入侵的必需宿主因子。

作者首先使用RVFV的致病性毒株ZH501感染CRISPR/Cas9构建的小鼠小胶质细胞系BV2文库，经二代测序分析，发现Lrp1、脂蛋白受体相关蛋白的相关蛋白（RAP）、内质网素（Grp94）为备选基因（图1）。Lrp1隶属低密度脂蛋白受体家族，表达范围广泛，在肝脏、胎盘和大脑中高表达；RAP是Lrp1的分子伴侣，可阻止配体结合Lrp1以保证其从内质网运往细胞表面；Grp64是内质网驻留的分子伴侣，通过抑制降解控制Lrp1的表达。

图1 文库筛选结果及备选蛋白细胞定位示意图

作者接着构建Lrp1敲除的BV2细胞株，进行ZH501毒株的感染实验，发现病毒感染效果减弱，且减弱效果在病毒感染早期（3h及6h）即已出现。进一步研究发现在Lrp1敲除的小鼠原代细胞中也存在病毒感染减弱的现象，上述结果说明Lrp1在病毒感染中发挥重要作用。作者还观察到，敲除Lrp1调节蛋白RAP和Grp64也对RVFV病毒感染产生相似的减弱效果，说明调节Lrp1表达对病毒入侵有重要作用。

Lrp1是一个分子量较大的多结构域蛋白，由一条515kD的胞外α链和一条约85kD的包含跨膜区的胞内β链组成，其α链上包含四段补体样重复簇（complement-like repeat clusters，CLI-IV），是配体结合活跃区。为确定Lrp1哪个重复簇参与病毒感染，作者在Lrp1敲除细胞株中补充不同的重复簇，发现CLII和CLIV可以部分恢复病毒感染，且后者贡献更大。接着通过CO-IP实验证实RVFV的Gn蛋白可以结合CLII和CLIV，而不结合CLIII。生物膜干涉（BLI）实验测定Gn更倾向于结合CLIV，结合亲和力为96±16 nM。此外，质谱结果显示， Lrp1与Gn的结合不依赖自身的糖修饰。作者进一步确认Lrp1敲除的BV2细胞株结合和内吞RVFV病毒粒子的能力减弱，同时对表面表达RVFV糖蛋白的VSV假病毒的结合能力也减弱，说明Lrp1是对RVFV的粘附和入侵十分关键的宿主因子，且结合依赖于病毒的Gn蛋白。

由于已报道的RVFV粘附因子（如DC-SIGN）并不影响去糖基化的病毒的感染能力及其与病毒Gn蛋白的结合能力，那么Lrp1的情况是否类似？作者测试了原核表达的不带糖基化修饰的Gn蛋白对RVFV感染的抑制作用，发现依然存在剂量依赖效应，表明Gn蛋白的糖基化修饰对RVFV入侵无影响。

既然已表明Lrp1对病毒入侵十分关键，作者接着使用噬菌体展示文库筛选特异靶向Lrp1 CLII和CLIV的Fab，以期发现可以阻断病毒粒子结合Lrp1的抗体。作者共获得四株抗体Fab，其中Fab15409特异性结合CLII（亲和力~2.3nM），Fab15408对CLII和CLIV均显示较高亲和力（分别为~1nM/11nM），Fab15438特异性结合CLIV（亲和力~1nM），Fab15430同时显示对CLII和CLIV的结合能力（分别为~40nM/10nM）。使用上述抗体进行体外细胞中和实验，靶向CLII的抗体IgG15408和IgG15409显示超过80%的中和效果，而靶向CLIV的抗体IgG15430和IgG15438显示超过50%的中和效果。进一步测得，可同时靶向CLII和CLIV的抗体IgG15408在中和实验中的EC50显示出936±78 ng/ml。上述实验确证Lrp1对RVFV感染的特异性，表明阻断Lrp1，尤其是其CLII部分，可以有效阻断病毒入侵。

在本研究筛选到的候选分子中，RAP此前已被证实可结合LRP1【5】。RAP共有三个结构域（D1-D3），其中D3负责结合LRP1的CLII和CLIV。作者使用BLI测试发现人源LRP1的CLII和CLIV均可结合鼠源RAPD3（mRAPD3）。进一步的结合实验显示高浓度的mRAPD3可以竞争Gn对LRP1的结合，提示mRAPD3可作为Lrp1抑制剂。作者测得mRAPD3对RVFV的EC50值为0.59±0.2 μg/ml，而mRAPD3突变体的阻断效果减弱。作者还测试了mRAPD3对RVFV感染小鼠、仓鼠、奶牛、猴、及人源细胞的阻断效果，均以剂量依赖型起效。此外，作者还发现mRAPD3仅在病毒感染前使用时有阻断效果，感染后再使用则失去阻断效果。

最后，作者选择对RVFV极易感的C57BL/6小鼠作为实验动物，评估mRAPD3是否可以阻止病毒感染小鼠脑，以评估其在体保护效果。作者发现在心内同时注射mRAPD3和致病毒株ZH501时，可以有效提高小鼠生存率。后续实验显示mRAPD3可以有效降低病毒对小鼠多种组织的损伤，而其突变体的保护效果明显减弱。上述概念验证实验再次确认Lrp1是RVFV感染啮齿动物的一个主要宿主因子。

尽管此前文献已报道多种RVFV感染相关的宿主因子，但实验显示诸如DC-SIGN、硫酸肝素等，更可能是病毒感染的粘附因子。本研究通过全基因组无偏筛选获得的候选分子Lrp1可以有效介导病毒入侵，可与RVFV的Gn蛋白直接结合；阻断Lrp1可以有效中和病毒感染，而回补Lrp1的相应重复簇有可恢复病毒感染；更重要的是，阻断Lrp1结合Gn的RAP蛋白可以在小鼠水平有效提高RVFV感染的生存率，因此确认Lrp1是裂谷热病毒的入侵因子，该发现为理解病毒感染、发病、传播机制的研究打开新的方向。当然，Lrp1介导RVFV入侵的具体机制还有待阐明，靶向Lrp1的治疗和预防手段开发有待进一步开发。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.001

参考文献

1、https://www.who.int/news-room/events/detail/2018/02/06/default-calendar/2018-annual-review-of-diseases-prioritized-under-theresearch-anddevelopment-blueprint.

2、Hassan, O.A., Ahlm, C., Sang, R., and Evander, M. (2011). The 2007 Rift Valley fever outbreak in Sudan. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1229.

3、Lozach, P.Y., Kühbacher, A., Meier, R., Mancini, R., Bitto, D., Bouloy, M., and Helenius, A. (2011). DC-SIGN as a receptor for phleboviruses. Cell Host Microbe 10, 75–88.

4、de Boer, S.M., Kortekaas, J., de Haan, C.A., Rottier, P.J., Moormann, R.J., and Bosch, B.J. (2012). Heparan sulfate facilitates Rift Valley fever virus entry into the cell. J. Virol. 86, 13767–13771.

5、Bu, G., and Schwartz, A.L. (1998). RAP, a novel type of ER chaperone. Trends Cell Biol. 8, 272–276.

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