CRISPR-Cas13 系统已被开发用于精准的 RNA 编辑，当需要临时更改或 DNA 编辑具有挑战性时，它有可能用于治疗。然而，基于 Cas13 的 RNA 编辑系统的治疗递送仍然具有挑战性，部分原因是迄今为止开发的基于 Cas13 的 RNA 编辑器的大小超过了腺相关病毒 (AAV） 的包装能力，腺相关病毒 (AAV） 是最广泛使用的基因递送病毒载体 。
2021年8月30日，博德研究所张锋团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Compact RNA editors with small Cas13 proteins”的研究论文，该研究已经鉴定并表征了一个超小型的 Cas13b 蛋白家族——Cas13bt——可以介导哺乳动物转录本敲低。 该研究通过用腺苷和胞嘧啶脱氨酶结构域功能化 Cas13bt 设计了 REPAIR 和 RESCUE RNA 编辑器的紧凑变体，并展示了编辑器在单个腺相关病毒中的包装，这从而进一步推进可编程 RNA 编辑技术的发展。
2021年8月20日，博德研究所张锋团队在Science 在线发表题为“Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery”的研究论文，该研究发现其中一种逆转录病毒样蛋白 PEG10 直接与细胞外病毒样衣壳结合并分泌其自身的 mRNA。然后将这些病毒样颗粒用融合剂进行假型化，以将功能性 mRNA 货物传递给哺乳动物细胞。这可能为基于 RNA 的基因治疗提供内源性载体。
2021年3月25日，博德研究所张锋团队在Cell 在线发表题为“Dual modes of CRISPR-associated transposon homing”的研究论文，该研究发现了CAST V-K和I-B两种系统不同的转座模式：（1）crRNA引导的转座和（2）CRISPR阵列独立的归巢。该研究显示了不同的CAST系统利用不同的分子机制来靶向其归巢位点。V-K型CAST系统使用短的，离域的crRNA进行RNA引导的归巢，而I-B CAST型系统包含两个不同的靶选择蛋白，使用TniQ进行RNA引导的DNA转座，并使用TnsD进行归巢到附着位点。这些发现阐明了CAST系统生命周期中的关键步骤，并突出了介导转座子归巢的分子机制的多样性。
RNA 靶向 CRISPR–Cas13 系统已被用于各种应用，包括可编程 RNA 编辑 。RNA 编辑是一种很有前途的治疗策略，它允许安装临时的、不可遗传的编辑。然而，基于 Cas13 的 RNA 编辑系统的治疗递送仍然具有挑战性，部分原因是迄今为止开发的基于 Cas13 的 RNA 编辑器的大小超过了腺相关病毒 (AAV） 的包装能力，腺相关病毒 (AAV） 是最广泛使用的基因递送病毒载体 。
为了克服这一限制，该研究对原核和病毒基因组和宏碁因组中的 Cas13 酶进行了迭代 HMM 谱搜索，确定了 5,843 个候选系统。系统发育分析揭示了在 Cas13b 和 Cas13c 亚型中形成不同分支的新型超紧凑 Cas13 蛋白组，以下分别称为 Cas13bt 和 Cas13ct。与其他 CRISPR-Cas13b 系统 6 不同，编码 Cas13bt 亚家族的基因组位点缺乏任何辅助基因。相对于 BzoCas13b（1,224 氨基酸（aa）），最小的 Cas13bt 蛋白（775-804 aa）有 26 个大（>5 aa）缺失，总共 408 aa。由于 Cas13b 蛋白在哺乳动物系统中比 Cas13c 蛋白更活跃并支持可编程 RNA 编辑 ，该研究将分析重点放在一组 16 种超紧凑 Cas13bt 蛋白（Cas13bt1 到 Cas13bt16）上。
为了通过实验表征 Cas13bt，该研究首先确定了所需的 CRISPR RNA (crRNA) 成分。该研究用包含 cas13bt 基因座之一 cas13bt2 的质粒转化大肠杆菌，其 CRISPR 阵列被截断为两个同向重复序列 (DR），并进行小 RNA 测序以确定成熟 crRNA 的构型。对于先前表征的 Cas13b 蛋白，Cas13bt2 的 crRNA 也被发现具有 3ʹ DR。 Cas13bt 亚家族的三个测试成员中的两个Cas13bt1 和 Cas13bt3，介导了大肠杆菌中靶向间隔子的消耗。对耗尽的 crRNA 靶向的侧翼位点序列的分析表明，Cas13bt1 和 Cas13bt3 都具有允许的 5ʹ D（A/G/T）原始间隔区侧翼序列（PFS）偏好。此外，靶向 5ʹ 非翻译区和编码序列起始处 (CDS） 的 crRNA 更缺乏。
先前已报道 Cas13 酶在 crRNA 引导下结合其单链 RNA 靶标时表现出附带的 RNA 切割活性。Cas13bt3 的体外评估表明 Cas13bt 还进行靶标激活的旁系 RNA 切割，并且这种旁系活动是由 HEPN 结构域介导的。这种靶标激活的附带活动可能使该亚家族适合用于诊断平台，如 SHERLOCK。
为了评估人类细胞中 Cas13bt 介导的 RNA 敲低的功效，该研究使用一组 20 个针对 Gaussia 荧光素酶 (Gluc) mRNA 的 crRNA 测试了 Cas13bt1 和 Cas13bt3。该研究发现这两种蛋白质都促进了 HEK293FT 细胞中 crRNA 引导的 Gluc 敲低。催化灭活 Cas13bt1 和 Cas13bt3 的 HEPN 结构域消除了它们的 RNA 敲低活性。Cas13bt1 和 Cas13bt3 还介导了 HEK293FT 细胞中 crRNA 引导的内源性转录物的敲低。
为了开发用于 RNA 编辑的 Cas13bt 蛋白，该研究将 Cas13bt1 和 Cas13bt3 的催化失活版本与 RNA 腺苷脱氨酶 ADAR2 催化域 (ADAR2dd-E188Q) 的高活性突变体融合，分别构建 REPAIR.t1 和 REPAIR.t3。该研究通过引入特定的 A-to-I 突变评估了这些可编程腺苷脱氨酶在 Cypridina 荧光素酶 (Cluc) mRNA 中恢复 W85X 突变的能力。该研究发现，对于用于靶向 Cluc 的 crRNA，当错配的靶腺苷位于靶位点 5ʹ 末端的 18–22 核苷酸内时，REPAIR.t1 和 REPAIR.t3 均显示出最佳编辑。
该研究另外构建了具有能够进行胞苷脱氨基作用的进化 ADAR2dd（RESCUE·t1 和 RESCUE·t3）的胞嘧啶 RNA 编辑器，并将两个编辑器引导至 HEK293FT 细胞中的报告基因和内源性转录物。该研究发现这些融合蛋白能够介导所有测试靶点的 C-to-U 编辑。
为了评估在单个病毒载体中使用 Cas13bt 融合蛋白的潜力，该研究将 REPAIR.t1 与 crRNA 表达盒一起包装在重组 AAV2 载体中，并将系统递送至 HEK293FT 细胞。免疫荧光染色表明 AAV 递送的 REPAIR.t1 在核输出信号的帮助下表达并定位到细胞质。RNA测序显示在转导细胞富集后，CTNNB1 T41位点的位点特异性A-to-I编辑率为7.5% ± 0.8%。这证明了使用单个 AAV 基因组进行递送的可行性。当尝试在体内递送至特定组织时，应选择 AAV 血清型以最大限度地提高递送和表达效率。
最后，该研究量化了 REPAIR.t1 的转录组范围特异性，发现该系统引入的脱靶编辑数量与 REPAIRv1 的数量相当。尽管 RNA 中的脱靶编辑是短暂的，但它们可能会产生有害的蛋白质产物，从而导致不利影响。为了提高 REPAIR 的特异性，该研究使用基于酵母的定向进化方法来鉴定 ADAR2dd 中两个有希望的突变（E620G 和 Q696L），这些突变减少了混杂的脱氨活性。该研究在 REPAIR.t1 中加入了这两个突变，发现脱靶编辑的数量减少了，而没有降低目标活性。通过额外的诱变和优化，甚至可以进一步降低脱靶活性。
总之，Cas13bt 蛋白的小尺寸为可编程 RNA 调节提供了新的机会，尤其是在体内。 该研究在此展示了 Cas13bt1 和 Cas13bt3 可用于生成与 AAV 递送兼容的紧凑型 REPAIR 和 RESCUE 结构，从而进一步推进可编程 RNA 编辑技术的发展。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41587-021-01030-2
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