南京农业大学王源超团队利用CRISPR/LbCpf1系统在大豆上实现高效多基因编辑及染色体大片段删除

大豆 (Glycine max) 是原产于中国，在世界各地广泛种植的重要经济作物，是人类饮食蛋白、植物油脂、畜牧饲料和化学工业等行业的重要原料 [1] 。由于大豆基因组复杂，基因重复以及功能冗余现象严重，使得大豆育种需要耗费较长的时间。基因编辑是近年来迅速发展起来的能够快速高效地改变物种性状的基因工程方法。它结合农杆菌介导的遗传转化、基因枪等方法对植物基因组上特定位点进行编辑，进而快速获得具有目标性状的种质资源，彻底改变了作物育种 进程。尤其是多基因编辑技术更是作为一种强有力的工具在作物育种中发挥着巨大的应用潜力。

CRISPR/Cpf1是近年来新发现的一种基因编辑系统，相较于Cas9，Cpf1具有双重切割酶活 性，能够独自地对crRNA前体进行加工。这使得Cpf1在实现多重基因编辑以及染色体片段删除方面具有明显优势。此外，Cpf1具有更为扩展的富含T的PAM识别序列(TTTN)，大大增加了它的应用范围。目前，CRISPR/LbCpf1实现了在哺乳动物和水稻中的多基因编辑[2, 3]，但在大豆中利用CRISPR/LbCpf1进行多基因编辑和染色体片段删除尚未报道。

近日，南京农业大学王源超教授团队在Journal of Integrative Plant Biology在线发表了题为“Large chromosomal segment deletions by CRISPR/LbCpf1-mediated multiplex gene editing in soybean”的研究论文。该研究在大豆中建立了一种高效、便捷的CRISPR/LbCpf1多基因编辑系统，实现了8个靶标的同时编辑，并在大豆中成功实现了染色体小片段(<1kb)、大片段(~10Kb)和超大片段(>10Kb)的删除。

该研究通过比较不同启动子以及crRNA array结构，建立了大豆CRISPR/LbCpf1基因编辑工具，编辑效率可达91.7%，测定到LbCpf1编辑窗口为-3rd-41rdbp。在此基础上，串联多个DR（Direct Repeat）和crRNA，构建了CRISPR/LbCpf1多基因编辑体系，实现了8个靶标的同时编辑，编辑效率可达17.1%。此外利用优化的CRISPR/LbCpf1多基因编辑体系，对大豆FAD2-A基因簇进行片段删除，成功实现了染色体小片段(<1Kb)、大片段(~10Kb)和超大片段(100Kb-1Mb)的删除，片段删除效率分别为36.5%、21.8%、9.5%。

该研究在大豆中实现了高效的多基因编辑及染色体片段删除，同时也扩充了在大豆研究中可运用到的基因编辑工具，可望在将来加速大豆分子育种进程。

CRISPR/LbCpf1实现多基因编辑和染色体片段删除的示意图

南京农业大学植物保护学院段凯旋副教授和硕士研究生成媛媛为该论文的第一作者，王源超教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金以及中央高校基本科研业务费的资助。

参考文献

1. 吕慧颖，王道文，葛毅强，魏珣，邓向东，杨维才，田志喜.(2018). 大豆育种行业创新动态. 植物遗传资源学报19:464-467

2.Zetsche, B., Heidenreich, M., Mohanraju, P., Fedorova, I., Kneppers, J., DeGennaro, E. M., Winblad, N., Choudhury, S. R., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Wu, W. Y., Scott, D. A., Severinov, K., van der Oost, J., and Zhang, F.(2017). Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat. Biotechnol.35:31-34.

3.Wang, M., Mao, Y., Lu, Y., Tao, X., and Zhu, J. K.(2017). Multiplex Gene Editing in Rice Using the CRISPR-Cpf1 System. Mol. Plant10:1011-1013.

论文链接：

https://doi.org/10.1111/jipb.13158