基因编辑效率惊人的升级版AsCas12a-加速细胞改造和临床应用

撰文 | 木兰之枻

2013年以来，CRISPR-Cas系统迅速崛起，如今已是基因编辑的主流技术。这其中，PAM识别序列为NGG的SpCas9核酸酶最早被应用于真核生物的基因编辑研究，也是CRISPR-Cas系统中的“顶流”【1，2】。考虑到SpCas9的PAM局限性，研究者又开发出PAM识别序列为TTTV的AsCas12a核酸酶用于基因编辑研究【3】。与SpCas9相比，AsCas12a具有多重优势，如编辑特异性高【4,5】，且crRNAs较短，更适合人工合成，这些优势有利于AsCas12a在临床治疗中的应用。不过AsCas12a的一大缺陷是编辑效率低，这让它难与SpCas9竞争。因此，提升AsCas12a的编辑效率对推动其在细胞基因组改造和临床治疗中的应用有重要意义。

近日，来自Integrated DNA Technologies（IDT）公司的Christopher A. Vakulskas实验室与Mark A. Behlke实验室合作，在Nature Communications发表题为AsCas12a ultra nuclease facilitates the rapid generation of therapeutic cell medicines的论文。文章对AsCas12a进行优化，获得了升级版本的AsCas12a Ultra。研究指出，在多种具有临床应用价值的细胞如造血干/祖细胞（HSPCs）、iPSCs、T细胞以及NK细胞中，AsCas12a Ultra的基因敲除效率接近100%，且基因编辑特异性依然维持在高水平。此外，AsCas12a Ultra同时敲除三种基因的效率超过90%，且基因定点敲入（Knock-in）的效率也高达60%。这种升级版的AsCas12a核酸酶可以大大加速临床级细胞的基因组改造和在治疗中的应用。

为筛选出具有高编辑活性的AsCas12a突变体，研究者采取了蛋白定向演化的策略。基本原理是，针对AsCas12a的I503-I905区域进行随机突变，然后通过抗生素筛选和细菌存活实验，富集可增强AsCas12a活性的点突变。经过数轮筛选，研究者发现两种点突变M537R和F870L可显著增强AsCas12a的编辑活性。此后研究者在人源细胞系中证实，AsCas12a的双点突变具有更强的编辑活性，这种突变体被命名为AsCas12a Ultra，并用于后续的研究。

研究者首先通过体外生化实验证实，AsCas12a Ultra的编辑特异性与野生型AsCas12a相似。随后的人源细胞实验发现，以核糖核蛋白 (RNP) 的形式应用时，AsCas12a Ultra的基因敲除活性较野生型有大幅提高：在PAM为TTTV的位点，AsCas12a Ultra的基因敲除效率高达97%，野生型只有33%。此外，AsCas12a Ultra在低温条件下（30℃）和各类不同的细胞中的表现均优于野生型。研究还指出，M537R和F870L两种点突变能有效提升可识别不同PAM位点的AsCas12a突变体的基因敲除效率，如识别TATV的AsCas12a RR和识别TYCV的AsCas12a RVR突变体。

除基因敲除效率有明显提升外，AsCas12a Ultra还显著增强同源重组（HDR）介导的基因敲入效率：以单链DNA（ssDNA）为模板时， AsCas12a Ultra介导的HDR编辑效率较野生型提高了一倍（8% vs 16%）。研究还指出，AsCas12a Ultra在很多位点的HDR效率甚至已经超越了SpCas9。

目前的临床治疗研究中，CAR-T为代表的细胞改造是热门领域。为进一步评估AsCas12a Ultra的临床应用价值，研究者对其在人原代细胞中的编辑能力进行了分析。原代T细胞、造血干/祖细胞、NK细胞以及iPSCs中的研究指出，AsCas12a Ultra的基因编辑能力（包括基因敲除和敲入）远强于野生型AsCas12a。研究还指出，虽然AsCas12a Ultra的基因编辑能力大幅提高，其脱靶效应仍保持在低水平，且远低于SpCas9。

研究还指出，与现有的AsCas12a突变体enCas12a（具有高编辑活性和更广的PAM兼容性）相比，AsCas12a Ultra更具优势：enCas12a对PAM的兼容性仍有不足，且基因编辑活性仅为AsCas12a Ultra的一半。

最后，研究者还在人原代T细胞和NK细胞中证实了AsCas12a Ultra超强的基因编辑能力。原代T细胞中，以RNP转染的AsCas12a Ultra能以93%的效率同时敲除3种基因。而利用AAV6作为同源重组模板，AsCas12a Ultra的基因敲入效率接近60%，同时敲入两种基因的效率也接近40%。NK细胞中，AsCas12a Ultra的基因敲除和基因敲入能力同样强大。

总体而言，本研究开发的AsCas12a Ultra具备强大的基因编辑能力：其在多种有临床应用价值的人原代细胞中均有超强的基因敲除和基因定点敲入能力，这将极大的推动基因编辑技术在临床治疗中的应用。这其中，AsCas12a Ultra在细胞基因组改造特别是CAR-T和CAR-NK细胞构建中的超强效果也意味着其在临床应用中具有广阔的前景。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41467-021-24017-8

参考文献

1. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823–826 (2013).

2. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).

3. Zetsche, B. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 163, 759–771 (2015).

4. Kleinstiver, B. P. et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 34, 869–874 (2016).

5. Kim, D. et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 34, 863–868 (2016).