寨卡病毒利用结状RNA的机械强度对抗细胞防御

撰文 | ZHAO Meng

责编 | 兮

RNA新功能的不断发现是分子生物学发展的一个重要课题。Exoribonuclease-resistant RNA, 简称xrRNA, 普遍存在于黄病毒 (Flavivirus)的3'端非编码区内，能抵御细胞防御体系中重要的5'至3'端外切核酸酶Xrn1的降解【1】。黄病毒属是一类以RNA为遗传物质通过蚊虫在世界广泛传播的病毒，包括登革热、寨卡病毒、黄热病和西尼罗河病毒等，目前尚无有效防治手段。研究表明，xrRNA保护病毒3'端非编码区RNA片段滞留于细胞内不被降解。经复制累积，这些外源RNA片段与多种蛋白分子结合，导致细胞功能异常。

寨卡病毒xrRNA的三维结构显示【2】，其 5'端单链穿过其自身折叠构筑的闭合环，形成 “结状构象 (knot-like conformation) ”，这种RNA打结的现象此前未见报道。此后，人们提出xrRNA抵御Xrn1降解的“路障 (mechanical roadblocks)”假说【3】：xrRNA的机械抗性 (mechanical resistance) 使其面对Xrn1施加牵引力时能够保持结构完整不被拖入Xrn1的酶催化活性中心。围绕该假说几个的核心问题有：xrRNA的机械抗性是否与常见的RNA二、三级结构存在显著差异，影响其抵御Xrn1的关键因素是什么，以及一个从未被观察过的现象—RNA分子是如何打结的？

2021年7月12日，来自阿尔伯塔大学的Michael T. Woodside实验室在Nature Chemical Biology 上发表题为Mechanical strength of RNA knot in Zika virus protects against cellular defenses的文章，发现寨卡病毒xrRNA的机械强度是决定其Xrn1抗性水平的关键要素，并首次描述了结状RNA的形成过程。赵猛博士是该文章 (合作导师除外) 的唯一作者。通讯作者为Michael T. Woodside教授。

作者使用双光束光镊 (Optical Tweezers) 对单个寨卡病毒xrRNA分子的末端施加力，通过改变力的强度诱导xrRNA三维结构的展开 (unfolding) 和再折叠 (refolding)，直接观察外力作用下xrRNA分子变化的完整步骤序列，确定了展开和折叠过程中出现的中间体并推导其结构。为进一步证实中间体结构，作者设计了三组反义短链DNA (antisense oligo) 与xrRNA的不同部位结合，促使一些不易被捕获的中间体形态能够稳定地呈现在眼前。

作者发现，xrRNA的核心结状结构 (Ir) 在60 pN以上的外力作用下仍能保持结构完整，是已知力学稳定性最高的RNA结构。然而， Ir的形成要求RNA必须严格遵循特定的步骤进行折叠：首先是完整二级结构骨架 (I1) 的形成；然后，5'末端横穿I1骨架内侧，并被两组氢键固定，该过程亦需要镁离子的协助；最后，远程相互作用的四组GC碱基对关闭分子环，形成紧密嵌合的结状RNA。有趣的是，作者也观察到了三种非结状RNA的形成：一是RNA折叠停留在二级结构层面 (I1)；二是分子环的关闭发生在5'末端横穿之前，导致后者被阻挡在分子环外；三是5'末端被锁定在内部区域，不能自由横穿分子骨架。不过，这些非结状结构，尤其后两种情况，发生的概率极小。

为探明xrRNA的力学性质与生物功能的关联，作者对比了wild type 与变异体C22G的单分子实验结果，发现两者都能形成Ir, 其概率与Xrn1抗性水平正相关。这说明Ir是赋予xrRNA生物功能的核心结构。然而，Ir包含了两个要素：结状结构和较高的机械抗性。为进一步探究哪个要素起到决定性作用，作者设计并研究了变异体U4C。研究发现，U4C大多时间都以类似Ir的结状形态存在，但其机械抗性远低于Wild type；Xrn1抗性实验表明，U4C 完全丧失了抵御Xrn1的能力。综合以上结果，xrRNA的机械抗性才是决定其生物功能的最关键要素，而并非表面上的结构特征。

本研究验证了关于寨卡病毒xrRNA“机械路障”的假说，揭开了结状RNA折叠过程中经历的一系列中间体形态。作者认为，靶向这些中间体结构能够抑制其最终折叠成具有Xrn1抗性的结状RNA, 这也许是一条发展抗病毒药物的有效途径。同时，该研究也暗示了另一策略：即便结状RNA的折叠不能被阻止，通过干扰几组关键氢键作用来削弱 xrRNA的机械强度，亦能使其失去抵抗细胞防御的能力。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41589-021-00829-z